同じファミリーに属する転写因子間の標的遺伝子の特異性のコントロール

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K06017
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 石井 いずみ (小田いずみ) 京都大学, 理学研究科, 特別研究員(RPD) (40624309)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2026-03-31
• Keywords: 転写因子 / 結合特異性 / 結合モチーフ / ホヤ / Zic

Outline of Annual Research Achievements

発生過程は、転写因子が協調して細胞の種類に応じ異なる標的遺伝子の発現を調節することで進行する。この過程で、同じファミリーに分類される転写因子は類似したDNA結合モチーフに特異的に結合するにも関わらず、それぞれ異なる標的遺伝子の調節を行う例が報告されている。このような同じファミリーに属する転写因子間の標的遺伝子の特異性はどのようにコントロールされているのかという問いの答えを探るために、本研究ではホヤ（Ciona intestinalis type A）胚を用いて、２つのZic因子がどのようにして共通のまたは異なる標的遺伝子の発現を活性化しているかを明らかにすることを目的としている。
令和３年度は、実験実施計画の「１、Zic-r.aとZic-r.bの転写因子としての機能に違いがあるかを明らかにする。」の内容を進めるために以下の実験を進めた。
①「２つのZic因子がホヤ胚内で互いの標的遺伝子の発現を活性化できるかの検証」のために、Zic-r.a、Zic-r.bおよび、Zinc finger domainをZic-r.bと取り替えたZic-r.aのmRNAを標的遺伝子のレポーターコンストラクトとともに胚に導入し、誘導されてくる異所的発現の量を比較した。
②「Zic-r.aとZic-r.bの細胞内のタンパク質量の比較」を行うために必要な抗体作成に取り掛かった。抗原として、Zic-r.bのDNA結合ドメインとしてはたらくzinc finger domainをGSTにつないだZic-r.bZF-GST融合タンパク質を作成した。また、GSTを含まないHis-tag融合タンパク質、His-Zic-r.bZF融合タンパク質も作成し、こちらは作成した抗体の力価測定に使用する予定である。抗体は次年度初頭に発注予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

令和３年度にZic-r.a、Zic-r.bおよびZinc finger domainをZic-r.bと取り替えたZic-r.aが、特定の標的遺伝子の調節領域を介して転写を活性化する際の効率を比較する実験を行ったことで、in vivoで２つのZic因子の転写調節機能を比較する手法を確立することができた。これにより今後予定しているin vivoでの実験を迅速に進めることが可能になった。これまでのところ、胚で誘導される発現をin situ hybridization法により検出し、異所的な発現が検出される細胞の数をカウントすることで、各Zic因子が転写を活性化する際の効率を比較するという手法を用いていた。しかし今後は、RT-qPCRでレポーター遺伝子の発現を検出することにより、より定量的な解析を行う予定である。
Zic-r.b抗体については、当初は令和３年度中に発注する予定であった。しかし当初抗原に使用する予定だったHis-Zic-r.b ZF融合タンパク質の大腸菌発現系での収率が低く、抗体作成に充分な量を用意することができなかった。そこで途中から抗原に用いるタンパク質をGST-Zic-r.bZF融合タンパク質に変更することにした。GST-Zic-r.bZF融合タンパク質は大腸菌発現系での収率が非常に高く、抗原として充分量用意することができた。抗体が完成した際には、力価測定にHis-Zic-r.bZF融合タンパク質を用いることで、Zic-r.bZFに特異性の高い抗体を選択し、その後の実験に使用する予定である。
Zic-r.b抗体は令和４年度初頭に発注する予定であり、令和４年度前半には完成し、「Zic-r.aとZic-r.bの細胞内のタンパク質量の比較」実験を開始することができると考えている。したがって、本研究はおおむね順調に進行していると考えている。

Strategy for Future Research Activity

令和４年度は以下の実験を行い、主に実験実施計画の「１、Zic-r.aとZic-r.bの転写因子としての機能に違いがあるかを明らかにする。」の内容を進める予定である。
「２つのZic因子が、ホヤ胚内で互いの標的遺伝子の発現を活性化できるかの検証」令和３年度にZic-r.a、Zic-r.bおよびZinc finger domainをZic-r.bと取り替えたZic-r.aについて標的遺伝子の発現を活性化する効率の比較を行ったが、令和４年度は、これにZinc finger domainをZic-r.aと取り替えたZic-r.bを追加し、さらに標的遺伝子のレポータコンストラクトの種類も増やして解析を行う。また誘導されるレポーター遺伝子の発現量の測定には、in situ hybridization法に加え、RT-qPCR法を用いる。
「Zic-r.aとZic-r.bの間でのZic １°モチーフと２°モチーフに対する親和性の比較」ゲルシフトアッセイにより、Zic-r.aとZic-r.bの各モチーフに対する親和性の違いを調べる。令和３年度にGST-Zic-r.bZF融合タンパク質が安定的に合成できることがわかったので、Zic-r.aについてもGST-Zic-r.aZF融合タンパク質を合成して実験を行う予定である。
「Zic-r.aとZic-r.bの細胞内のタンパク質量の比較」令和４年度前半にZic-r.b抗体の作成が完了した際には、蛍光抗体染色でZic-r.aおよびZic-r.bタンパク質を検出しする。シグナル強度を比較することで、各細胞の核内のZic-r.aおよびZic-r.bタンパク質量の違いを測定する。Histone proteinの抗体染色も同時に行い、シグナル強度を比較する際のinternal controlとして使用する。

Causes of Carryover

次の２つの理由で次年度使用が生じた。①参加を予定していた学会のリモート開催への変更や開催延期により、予定していた旅費が必要なくなったため。②予定していた抗体の発注が、抗原の準備の遅れのため次年度に持ち越されたため。
したがって持ち越した助成金は、令和４年度に持ち越した抗体作成に使用する予定である。また、延期された学会への参加の旅費に使用する予定である。