2022 Fiscal Year Research-status Report
Measurement of histone modification propagation velocity in a single living cell using CRISPR and BiFC
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21K06020
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
岡田 悟 九州大学, 医学研究院, 助教 (30734488)
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2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 出芽酵母 / CRISPR/Cas / ガイドRNA / イメージング / DNA二本鎖切断 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒストンの翻訳後修飾は、DNAのメチル化と並んで、エピジェネティック制御における中核的な分子機構である。その動態を理解するためには、「どのタイミングで」「どの細胞において」「どの種類の修飾が」「細胞核内のどの領域において」「ゲノム上のどの位置で」生じるのかを調べる必要がある。本研究では、CRISPR/Cas9システム、ヒストン修飾認識ドメイン、Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)を組み合わせて利用する。
本研究では、これらの組み合わせにより、上記の情報要素すべてを同時に取り出すことのできるイメージング手法を確立し、これを用いてヒストン修飾がゲノム上を伝搬していく速度を単一の生細胞単位で計測する。このような計測を通じて、細胞ごとにヒストン修飾伝搬速度はどの程度バラつきうるのか?修飾酵素のリクルート因子やヒストンリモデラーの変異はヒストン修飾伝搬速度に対して単一細胞単位でどのような影響を及ぼすのか?クロマチンの核内位置とヒストン修飾伝搬速度の関係は?といった、これまで検証されてこなかった疑問に対して答えを得ることを目的とする。
今年度は、CRIPSR/Cas系を用いてゲノム上の特定位置にDNA二本鎖切断を生じさせるためのガイドRNAを効率よく選抜することを企図して、細胞内でのガイドRNAの機能性を評価するための簡便なイメージング手法の開発を試みた。一本鎖DNA結合タンパク質であるRPAを蛍光タンパク質タグで可視化し、その輝度を観測することで、Cas-gRNA複合体によるDNA DSB形成効率を評価する系を構築し、蛍光輝度とゲノム編集効率の間に高い相関が見られることを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
一本鎖DNA（ssDNA）結合タンパク質であるRPA（出芽酵母ではRfa1/Rfa2/Rfa3）は、DNA二本鎖切断（DSB）の修復時、リセクションによって生じたssDNA部分に集積する。Rfa1を蛍光タンパク質mNeonGreen（mNG）で可視化し、その輝度を観測することで、Cas-gRNA複合体によるDNA DSB形成効率を評価することができると考えた。
まず、ゲノム編集成功率とRfa1-mNG輝度の間の関係性を調べた。Cas9とRfa1-mNGを発現する菌株で各種のgRNAを発現させ、Rfa1-mNG輝度を測定した。同じgRNAを用いてゲノム編集（蛍光タンパク質遺伝子のノックイン）を実施し、その成功率を評価した。Rfa1-mNG輝度とゲノム編集成功率の間には強い相関が見られた。同様の実験をCas12aで実施した場合も強い相関が見られた。
続いて、本手法をdCasベースのアプリケーションへ応用することを試みた。dCas9-mNGを使ってCUP1アレイ（～16コピーのタンデムリピート）遺伝子座を可視化する系をモデルとして利用した。Cas9とRfa1-mNGを発現する株およびdCas9-mNGを発現する株で各種のgRNAを発現させた。前者の株のRfa1-mNG輝度と後者の株でCUP1アレイを可視化できた細胞の割合の間には、正の相関が観察された。Rfa1-mNG輝度をCUP1アレイ可視化効率の予測因子とみなした場合、その予測精度は85%以上であった。
本手法は、オンターゲットとオフターゲットの切断を識別できない可能性が高いという短所が想定されるものの、gRNAを選抜する（特に、機能性が低いgRNAを早い段階で排除する）ためのシンプルで汎用性の高い方法となり得ると考えられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度までに、GFP結合タンパク質を用いて蛍光タンパク質の褪色を遅延させる手法およびRPAのイメージングを用いて効率よく機能的なガイドRNAを選抜する手法を確立した。
今後は、BiFCに対しても、GFP結合タンパク質を用いて蛍光タンパク質の退色を遅延させる手法を適用する。VenusによるBiFCを観察できることが既知である核小体タンパク質ペアNet1-Sir2をモデルとして、GFP結合タンパク質の共発現によってBiFCシグナルの退色遅延が生じるかどうかを確認する。上記のモデルケースでGFP結合タンパク質の共発現によるBiFCシグナルの退色遅延が確認されれば、クロマチン上で生じたBiFCシグナルを長時間にわたって観察することを企図して、近接した位置に標的配列を設定したdSpCas9-dSaCas9間のBiFCシグナルの退色速度に対するGFP結合タンパク質共発現の効果を測定する。
ゲノム上の特定位置でのDNAの二本鎖切断を生細胞内で可視化できる出芽酵母細胞株を作成する。まず、RPAのイメージング手法を用いて、高効率でDNA二本鎖切断（DSB）を導入できるガイドRNAを選抜し、DNA DSB導入位置を確定する。そのうえで、ParBタンパク質集積の起点となるparS配列をDNA DSB導入予定部位に隣接する位置にノックインする。蛍光タンパク質を融合させたParBを発現させると、ParBはparS配列をコアとして、DNA上に一次元的な広がりをもって結合し輝点を形成するが、DNA二本鎖切断によって引き起こされるリセクションによってその結合が失われ、輝点が消失する。この輝点消失タイミングをDNA二本鎖切断タイミングとして観測することができると考えられる。選抜したガイドRNAを用いてDNA DSBを誘導し、ParB起点消失観測のための条件を最適化する。
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| Causes of Carryover |
（理由）顕微鏡イメージング向け消耗品について、ガラス製からプラスチック製に変更しても計測データの質が実用上十分維持されることを確かめることができた。この結果を受けて、顕微鏡向け消耗品の一部を低価格なプラスチック製品に変更することで全体のコストを削減することができたため。
（使用計画）生細胞イメージングのシグナル/ノイズ比の向上を企図して、ナローバンド蛍光フィルターセットの購入に充てる計画である。
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