2021 Fiscal Year Research-status Report

カリウムチャネルKcsAの脂質内高分解能構造解析によるゲーティング機構の解明

Research Project

Project/Area Number	21K06030
Research Institution	Osaka University
Principal Investigator	高崎寛子大阪大学, 蛋白質研究所, 助教 (50610432)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	清水啓史福井大学, 学術研究院医学系部門, 講師 (50324158) 安永卓生九州工業大学, 大学院情報工学研究院, 教授 (60251394)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	膜タンパク質 / クライオ電子顕微鏡 / 単粒子解析 / ナノディスク
Outline of Annual Research Achievements	本研究は、イオンチャネルのモデルタンパク質であるKcsAの構造解析を行い、多様に存在するイオンチャネル間の共通のゲーティング機構を明らかにすることを目的としている。そのためにまず、ナノディスク技術を用いて生体内と同じ脂質二重膜内に存在するKcsAを精製する。さらに、KcsAは中性溶液中で閉構造、酸性溶液中で開構造を取ることから、中性条件だけでなく、酸性条件でもナノディスクに埋め込まれたKcsAを準備する。これら中性条件、酸性条件にあるKcsAをクライオ電子顕微鏡単粒子解析法を用いて構造解析する。この時、3 Å分解能での構造取得を目標とし、イオンチャネルに共通のゲーティング機構を原子レベルで明らかにする。本年度はまず、ナノディスクの材料となるmembrane scaffold protein (MSP)を準備した。この時、分子量が70k Daと非常に小さなKcsAに対応できるよう、形成ナノディスクの直径が小さい、MSP1D1(ナノディスク直径9.6 nm)とMSP1E3D1(ナノディスク直径12.1 nm)の2種類を発現・精製した。精製したMSPと使用脂質候補の1つである大豆脂質を用いてナノディスクを形成させ、負染色法により電子顕微鏡で形状を確認した。その結果、それぞれ均質な大きさのナノディスクが観察された。今後は、大豆脂質以外の脂質を用いてナノディスク形成能を確認し、さらに実際にKcsAを含んだナノディスクを精製して、KcsAの機能解析とクライオ電子顕微鏡単粒子解析法を用いた構造解析を行う。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 精製度の低い大豆脂質を使用してナノディスクを形成させたためか、実験開始当初、目的としたナノディスクだけでなく、ざまざまな大きさのミセルも同時に精製された。MSPと脂質の量比を検討することで、この問題は解決できたが、KcsAを含むナノディスクの精製までは至らなかった。
Strategy for Future Research Activity	精製度の高い脂質を使用してナノディスク形成のスクリーニングを行う。いくつか脂質の候補を選択したのち、KcsAを含むナノディスクを精製し、KcsAに最適な脂質とMSPを選択する。同時並行で、ナノディスクに含まれたKcsAの機能解析とクライオ電子顕微鏡での観察を開始する。
Causes of Carryover	ナノディスク形成検討実験に時間がかかり、予定していた実験までいたらなかったため。