2021 Fiscal Year Research-status Report
オルガネラ間コンタクトを担う低親和性タンパク質複合体の溶液NMR解析
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21K06047
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
古板 恭子 大阪大学, 蛋白質研究所, 特別研究員(RPD) (30727665)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 溶液NMR / タンパク質複合体 / 膜コンタクトサイト / 分子間相互作用 / VAP / FFAT-likeモチーフ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
小胞体膜貫通タンパク質Vesicle-associated membrane protein-Associated Protein (VAP)は小胞体と他のオルガネラあるいは細胞膜とのコンタクトサイトにおけるタンパク質間相互作用を担うタンパク質である。VAPのN末端側にあるMajor Sperm Protein (MSP)ドメイン(VAPMSP)は、FFATモチーフという７アミノ酸残基からなるアミノ酸配列「EFFDAxE」を結合することが知られている。近年、VAPMSPはFFATモチーフのコンセンサス配列の複数の残基が置換された非常に多様な配列を結合することが明らかになってきた。これらの配列はFFAT-likeモチーフと呼ばれている。VAPMSPとFFAT-likeモチーフの相互作用は様々な細胞機能に重要であることが示されている。しかし、VAPMSPがどのようにFFAT-likeモチーフを認識するのかは不明である。
本研究では、これまでにVAPMSPとの結合が文献で報告されているFFAT-likeモチーフの配列を含む11種類のペプチドを用い、溶液NMR法により、それらとVAPMSPとの結合を検討した。化学シフト摂動実験により、これらのペプチドは通常のFFATモチーフと同じ結合サイトに結合することが分かった。また、NMR滴定実験により、FFAT-likeモチーフとVAPMSPとの結合定数は数 mMと、通常のFFATモチーフより1桁以上大きいことが分かった。さらに、比較的強く結合するFFAT-likeモチーフはフェニルアラニン残基およびアラニン残基を含み、VAPMSP表面にある2つの疎水性ポケットと相互作用することが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
溶液NMR法により11種類のFFAT-likeモチーフについてVAPMSPにおける結合部位を決定し、うち３種類については解離定数も決定した。また、FFAT-likeモチーフとVAPMSPとの結合に重要な相互作用についての洞察も得ることができたため、概ね順調に進展しているといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
FFAT-likeモチーフとVAPMSPとのより詳しい相互作用情報を得るために、13C標識VAPMSPと非標識ペプチドからなる試料を用い、13CフィルターNOESY実験を行うことで、分子間距離情報の取得を試みる。また、FFAT-likeモチーフ中のアミノ酸のリン酸化により、VAPMSPとの結合が強くなるという論文が発表されたため、リン酸化FFAT-likeモチーフを含むペプチドとVAPMSPとの結合様式ならびに結合力を溶液NMR法を用いて検討し、リン酸化がない場合と比較する。
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