2022 Fiscal Year Research-status Report
Structural basis for dynamic kinetochore assembly essential for chromosome segregation
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21K06048
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
有吉 眞理子 大阪大学, 大学院生命機能研究科, 特任助教(常勤) (80437243)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 染色体分配 / キネトコア / セントロメア / クライオ電顕 / タンパク質複合体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
染色体の均等分配は、染色体上のセントロメア領域に形成されるキネトコアと呼ばれる超分子構造体によって制御される。キネトコアは、セントロメアのマーカーであるCENP-A ヌクレオソームを認識し、セントロメア上に会合する。キネトコアは2つの階層構造からなり、第一に、細胞周期を通して、常にセントロメア領域に会合している構成的セントロメア局在ネットワークタンパク質群（CCAN）がキネトコアの足場を形成する。細胞分裂時には、その外側に、紡錘体微小管との直接結合するKMNネットワークとよばれるタンパク質構造体が形成される。本研究の目的は、細胞周期依存的に変化するキネトコアにおける分子会合モードの制御機構の解明である。当初、CCANコア複合体中、間期特異的に形成されるCENP-C/CENP-LN複合体の構造機能解析を計画していたが、研究期間中に、CENP-C、CENPLN複合体を含むヒトのCCANコア構造が報告されたため、研究方針を修正し、下記の２つの研究項目を行った。
1)ニワトリのDT40細胞を用いたCCAN複合体の精製、機能解析
試験官内で再構成した複合体の構造知見のみでは、細胞周期依存的なCCANの構造制御を理解するには至らない。実際に細胞内で起こっているCCANの構造変化の実態を調べるため、ニワトリのDT40細胞から精製したCCAN複合体のクライオ電顕を用いた単粒子解析をおこなった。
2)細胞周期依存的なKNL2タンパク質のCENP-Aヌクレオソーム結合
先行研究によってCCANコア複合体の構造が明らかになったが、間期におけるCENP-Aヌクレオソームの認識を担う因子、その制御機構は不明なままである。本研究では、クライオ電顕を用いた単粒子解析により、細胞周期依存的なニワトリKNL2タンパク質によるCENP-Aヌクレオソーム認識の構造基盤を明らかにし、新しい機能モデルを提唱した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1)ニワトリのDT40細胞を用いたCCAN複合体の精製、機能解析に関しては、現在、低分解能のクライオ電顕像しか得られていないが、引き続き、精製・解析方法を改善し、単粒子解析を行う予定である。
2)細胞周期依存的なKNL2タンパク質のCENP-Aヌクレオソーム結合については、構造解析、機能解析が終了し、学術論文として発表した。
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| Strategy for Future Research Activity |
1)ニワトリのDT40細胞を用いたCCAN複合体の精製、機能解析
当該年度では、ニワトリのDT40細胞から精製したCCAN複合体のニワトリのDT40細胞を用いたCCAN複合体の精製、機能解析クライオ電顕による構造解析をおこなった。現在、低分解能のクライオ電顕像しか得られていないが、引き続き、精製・解析方法を改善し、単粒子解析を行う予定である。アフィニティータグの種類・組み合わせを変えるなど、より効率的に複合体を単離するための精製方法を改善することが可能であると考える。
２）細胞周期依存的なKNL2タンパク質のCENP-Aヌクレオソーム結合
これまでに、KNL2とCENP-Aヌクレオソームの結合が間期特異的に起こることを明らかにしている。また、分裂期には、他のCCANタンパク質との相互作用によって、KNL2がセントロメアに局在することを示唆するデータを得ている。今後、生化学的な手法を用いて、KNL2とCCAN構成因子との相互作用を調べる予定である。
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| Causes of Carryover |
当該年度では、クライオ電顕像解析及び成果発表のための論文執筆、追加実験を行うことに重点をおいたため、試料調製、生化学的な解析のために使用する予定の研究費を次年度に持ち越した。次年度では、クライオ電顕像解析にむけ、培養細胞からの複合体精製の系を確立、複合体の精製を行うことを予定しており、細胞培養ための試薬、消耗品費などに充てる。また、論文発表したKNL2の構造解析の結果に基づいて、機能解析が進行中であり、そのための消耗品費用などに使用する。
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