2021 Fiscal Year Research-status Report
ノルアドレナリン合成に関わる小胞型アスコルビン酸トランスポーターの同定
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21K06068
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
表 弘志 岡山大学, 医歯薬学域, 准教授 (10273707)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | アスコルビン酸 / ノルアドレナリン / トランスポーター |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ノルアドレナリンは自律神経から分泌される主要ホルモンの１つであり、副腎のクロマフィン細胞でドーパミンから生合成されている。この過程はクロマフィン細胞に存在するクロマフィン顆粒（分泌小胞）内で行われ、アスコルビン酸を必須因子としている。基質になるドーパミンは小胞型モノアミントランスポーター（VMAT）によって顆粒内に取り込まれ、その後DβH（ドーパミンβヒドロキシラーゼ）によって水酸化されてノルアドレナリンに変換される。この酵素はアスコルビン酸を補酵素とするため、ノルアドレナリン生合成にアスコルビン酸が不可欠となっている。実際、クロマフィン顆粒内にはノルアドレナリンとともにアスコルビン酸が蓄積していることが知られていた。
このように、ノルアドレナリン生合成の概要は明らかになっているかのように見えるが、アスコルビン酸は必須因子であるにも関わらず、クロマフィン顆粒内に輸送・蓄積するトランスポーターは未だ見つかっていない。これまでにアスコルビン酸トランスポーターを同定する試みが行われてきたが、いずれも当該トランスポーターの発見には至らなかった。我々は発想を変え、酸化型のアスコルビン酸が小胞内に輸送された後、還元されるものと考えた。
本研究ではこれまでの解析から、細胞内膜型グルコーストランスポーターがアスコルビン酸を小胞に運ぶトランスポーターの実体であると考え、GLUT8を候補トランポーターとして選定した。本年度はGLUT8の細胞内局在解析および、クロマフィン顆粒を用いたノルアドレナリン合成活性測定系の確立を行なった。単離クロマフィン細胞を用いた免疫組織化学的解析から、GLUT8はクロマフィン顆粒に存在するものと推定された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
グルコーストランスポーター(GLUT)は細胞膜にあってグルコースを促進拡散によって輸送するトランスポーター群である。GLUTはグルコースの他に様々な糖を輸送することが知られており、酸化型のアルコルビン酸であるデヒドロアスコルビン酸も輸送することが報告されている。我々はGLUTがクロマフィン顆粒に存在し、デヒドロアスコルビン酸を輸送しているものと考えてPCR法、免疫染色法、ウエスタンブロット法による発現解析を進めた。
マウス副腎からクロマフィン細胞を単離し、抗マウス GLUT8抗体で染色したところ、顆粒状のシグナルが見られた。この顆粒はクロマフィン顆粒のマーカーであるクロモグラニンに対する抗体でも染色され、両者の相関係数は0.97とほぼ一致した。このことから、GLUT8はクロマフィン顆粒に存在するものと推定された。
また、ウシ副腎からクロマフィン顆粒を単離し、HPLCを用いてノルアドレナリン合成活性を測定する系を確立した。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度以降の予定は下記の通りである。
(1) 単離クロマフィン顆粒を用いてノルアドレナリン合成がVMAT阻害剤であるレゼルピン、V-ATPase阻害剤であるバフィロマイシン、GLUT阻害剤であるサイトカラシンとフロレチン、シトクロムb561阻害剤であるアンチマインの効果を検討する。酸化型アスコルビン酸がGLUTによって顆粒内に運ばれ、シトクロムb561で還元されるならばこれらの阻害剤でノルアドレナリンの合成が阻害されるはずである。
(2) 単離クロマフィン細胞を用いてGLUT8 RNAi実験を行う。クロマフィン細胞の固着性が悪い場合はディッシュではなくエッペンドルフチューブを用いた方法に切り替える。
(3) 単離クロマフィン細胞を用いてGLUT8と他の細胞内オルガネラマーカーの共局在解析を行う。
(4) 単離クロマフィン顆粒を用いて、グルコースの輸送解析を行う。
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| Causes of Carryover |
実験系確立が予定より進み、本年度使用額が少なかったため。
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