2021 Fiscal Year Research-status Report

Sorting mechanism of processing enzymes to the secretory granules.

Research Project

Project/Area Number	21K06070
Research Institution	Akita Prefectural University
Principal Investigator	穂坂正博秋田県立大学, 生物資源科学部, 教授 (80311603)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	分泌顆粒 / ペプチドホルモン / 選別輸送 / プロセッシング酵素
Outline of Annual Research Achievements	内分泌細胞の分泌顆粒でペプチドホルモン前駆体は、分泌顆粒膜上に集積する様々な活性化酵素によって切断・修飾され生理活性のあるホルモンに成熟する。しかし、ホルモン前駆体と活性化酵素群がともに分泌顆粒に選別輸送される分子機構については未だ解明されていない。そこで、本研究では、分泌顆粒基質のセクレトグラニン II および III（Sg2、Sg3）に着目し、これらの分子がこのホルモン前駆体と活性化酵素群の共輸送過程で果たす役割を、Sg2-、Sg3-欠損 (KO) マウスを活用して生化学的手法で検討する。本研究課題では、内分泌細胞株およびSg2やSg3の遺伝子欠損マウスを活用して、具体的に以下の3点を明らかにする。 A. Sg3がホルモン活性化酵素を分泌顆粒に選択的に集積させる仕組みの解明：これまで申請者が進めてきたSg3の生化学的解析を発展・深化させ、Sg3と各ホルモン活性化酵素との直接的相互作用の検証や結合ドメインの同定、Sg3と結合する新規分子の網羅的探索を行い、ペプチドホルモン前駆体に活性化酵素群を集積・近接させる分子機構を明らかにする。 B. Sg2がホルモン活性化酵素を分泌顆粒に選択的に集積させる仕組みの解明：Sg3/CgA系とは独立して分泌顆粒形成に寄与するSg2がどのようにホルモン活性化酵素群を分泌顆粒に集積させ機能させるかについて、上記Aと同様に生化学的手法で明らかにする。 C. Sg2にもSg3にも依存しないホルモン活性化機構の有無の検証：上記AとBの解析結果を踏まえて、ペプチドホルモン活性化過程でSg2とSg3の2つのグラニンが必須かどうかを、Sg2/Sg3-DKOマウスを作出・解析して明らかにする。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 2021年度について下記の研究を行い現在解析を続けている。 1) Sg2, Sg3およびプロセッシング酵素群について、抗体を用意して免疫沈降法で結合を解析しつつある。候補タンパク質について、市販抗体が十分に機能しないものは、新たに抗体を作製することで対応した。 2) WT, Sg2-KOマウス、Sg3-KOマウスの脳下垂体からmRNAを精製しDNAアレイによる解析を行った。 3) WT, Sg2-KOマウス、Sg3-KOマウスの内分泌組織を顕微鏡下で比較している。
Strategy for Future Research Activity	1) 2021年度に新たなグラニンタンパク質群とプロセッシング酵素群の組み合わせを得た。2022年度以降は新規パートナーの組み合わせに着目して顕微鏡下の観察、ホルモン分泌を調べる。 2) ペプチドホルモン活性化過程でSg2とSg3の2つのグラニンが必須かどうかを、Sg2/Sg3-DKOマウス（またはSg2, Sg3: -/-, -/+ or -/+, -/-)を作出・解析して明らかにする。