2022 Fiscal Year Research-status Report
Cas9タンパク質の制御によるCRISPR/Cas9オフターゲット編集の抑制
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21K06075
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| Research Institution | National Institute of Health Sciences |
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Principal Investigator |
柴田 識人 国立医薬品食品衛生研究所, 生化学部, 室長 (30391973)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / Cas9 / タンパク質制御 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集技術において、「意図しない変異(オフターゲット編集)」を抑制することが課題となっている。本技術のさらなる安全性の向上を目指すためには、CRISPR/Cas9システムを時空間的に精密に制御することが求められている。一方で哺乳類細胞に発現させたCas9タンパク質が比較的安定であるという報告もあることから、適切なタイミングでCas9タンパク質の発現量を調節するシステムの構築が必要であると考えられている。本研究では、Cas9タンパク質がどのように して哺乳類細胞内で安定に発現するのかその分子機構の解明を試みると共に、この知見を利用するなどして、Cas9タンパク質の哺乳類細胞内での発現量を適切かつ精密に制御するシステムの構築を目指している。
今年度の研究成果は以下の通りである。
1) 昨年度構築した、薬剤依存的にCas9タンパク質の発現を誘導する機構とCas9タンパク質の分解を誘導する機構を組み合わせたシステムについて、特に分解誘導の分子機構に関する検討を行い、想定されるように、E3リガーゼを介したユビキチン-プロテアソーム系によってタンパク質分解されていることを明らかにした。
2) このCas9タンパク質の発現誘導機構と分解誘導機構を組み合わせたシステムについて、用いる分解タグと分解誘導剤を変えることで複数のシステムを用意した。これらを複数の細胞に導入することで、Cas9タンパク質の発現/分解誘導に関する条件検討を行い、Cas9タンパク質を精密に制御する最適な条件を見い出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は、Cas9タンパク質の細胞内発現量を制御するシステムの確立と、Cas9タンパク質量の制御がゲノム編集技術における意図しない変異の抑制に対して与え る影響の検討が目的であり、本目的を遂行するためにはCas9タンパク質の発現量を精密に制御できるシステムは必要不可欠である。昨年度に構築した薬剤依存的なCas9タンパク質 の発現誘導機構と分解誘導機構を組み合わせたシステムについて、その分解機構を明らかにしたことで、今後得られる意図しな い変異に関する結果について正しい考察が可能となる。また複数用意した分解システムとこれを導入する細胞の組み合わせを検討することで、Cas9タンパク質の発現量の精密な制御を観察できる最適な実験条件を見出すことができたことから、精密にCas9タンパク質量を制御することによる意図しない変異の抑制への影響を正しく評価することが可能になった。従って本研究は順調に進展していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに構築したCas9タンパク質の発現誘導/分解誘導システムについて、最適な実験条件のもとゲノム編集を実行し、Cas9タンパク質の発現時間によるオンターゲット編集やオフ ターゲット編集の効率とその割合への影響を検討することで、CRISPR/Cas9によるゲノム編集におけるオフターゲット編集の低減と安全性及び信頼性の向上に寄与で きるシステムの提起を目指す。
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| Causes of Carryover |
(理由) 研究進捗自体は順調であったが、新型コロナウイルス感染症及びロシア-ウクライナ問題などにより、研究消耗品の入手や実験の実施が困難な時期があり、当該次年度使用額が生じ た。
(使用計画) これまでに構築したCas9タンパク質の発現制御システムを用いて、Cas9タンパク質発現時間とゲノム編集効率やその割合への影響を検討するべく、実験遂行に必 要な一般試薬や実験用プラスティック器具器具などとして相当額を使用する。また研究成果研究成果の発表(論文発表や学会発表)として相当額を使用する予定 である。
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