2022 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of the functions of factors involved in the maintenance of plasma membrane sterols and search for novel factors
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21K06076
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
岸本 拓磨 北海道大学, 遺伝子病制御研究所, 助教 (70585158)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | ステロール / 脂質分布 / 分子状態 / 出芽酵母 / 脂質輸送 / リン脂質合成酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ステロールは真核生物の細胞膜で高濃度に維持されている。この維持メカニズムは完全には解明されていないが、従来、脂質輸送タンパク質による制御を中心に議論されてきた。我々は最近、細胞膜のリン脂質の非対称性がステロール分子の細胞膜での維持に重要であること、また、脂質輸送活性を持たない細胞膜タンパク質であるSfk1が、ステロール分子を細胞膜に維持することを明らかにした。今回、同定した因子が示すような脂質の膜分布における機能はこれまで報告されていない。それゆえ、いまだに維持機構については多くの点が未解明である。
本研究では、細胞膜のステロール分子の維持機構においてタンパク質や脂質がどのように関与しているかを解明することを目指す。この目的のために本研究では、脂質膜環境の変化によりステロールが脂質二重膜表面に露出し、細胞質タンパク質などとのステロールの反応性が促進される「ステロール活性化」という物理状態に着目して研究を進める。我々は、出芽酵母におけるエルゴステロール（真菌ステロール）の活性化を可視化するプローブ（GFPen-D4H）を開発した。このプローブを用いて、同定したSfk1の機能を解明するとともに、同様の’活性を持つタンパク質について他に存在する可能性を模索する。
現在、以下の3つの課題に取り組んでいる。(1) 脂質関連変異体を用いて、エルゴステロールの活性化に関与する遺伝子を単離する。(2) 人工膜を用いた実験により、Sfk1がエルゴステロールの活性化を制御する機構を解明する。(3) 遺伝子スクリーニングにより、エルゴステロールの物理状態を制御する新しい細胞膜タンパク質を探索する。これらの計画から、制御因子を同定し、細胞膜ステロール制御機構の全容を解明したいと考えている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1）令和３年度に明らかにしたエルゴステロールの活性化に関わる細胞膜脂質の関連遺伝子変異株について、令和４年度は遺伝学的相互作用を中心に解析した。GFPen-D4Hの分布に変化を示した変異株の中で、Lamタンパク質（StARt like domainタンパク質）と細胞膜リン脂質合成酵素の遺伝子欠損により、GFPen-D4Hの分布パターンに顕著な変化が認められた。Lamタンパク質は表層小胞体に分布しステロール輸送に関わる。また、リン脂質についてはステロールと相互作用するため、合成酵素の遺伝子変異は脂質の組成を変化させることによりステロール分子周囲の環境が影響を受けたと予想される。その一方、これらの変異を組み合わせた場合、合成致死性を示すことも見いだした。この条件致死変異株を構築し表現型解析を進めたところ、細胞膜形態の劇的な異常が認められた。これらの結果は、細胞膜脂質が相互作用してステロールの活性化を制御している可能性を示唆している。
2）人工膜を用いたSfk1のエルゴステロール活性化の制御機能を検証する。 本年度は、膜タンパク質Sfk1を酵母細胞から抽出・精製することを目指した。出芽酵母における高タンパク発現系を確立し、Sfk1タンパク質の大量調製に成功した。プロテオリポソームの作成するため、脂質膜の導入条件の検討を進めている。
3）エルゴステロールの活性化状態を制御する新規細胞膜タンパク質を単離するための遺伝子スクリーニングを行う。遺伝子欠損ライブラリーから約500株の細胞膜タンパク質の関連遺伝子欠損株について、ステロール関連薬剤による感受性試験とGFPen-D4H分布を指標にした顕微鏡観察スクリーニングを行った。令和４年度には前年度に行った一次スクリーニング以降のステップを進めた。GFPen-D4Hのパターンの分類とともに遺伝子機能との相関を調べ、最終的に１３遺伝子を特定した。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和５年度はLamタンパク質と細胞膜リン脂質合成酵素の変異が示す合成致死性について原因の究明を精力的に進める。構築した条件致死変異株について顕微鏡観察による細胞生物学的表現型解析と遺伝学的アプローチによる解析を中心に行う予定である。表現型解析では具体的に次のような実験を計画している。１）細胞膜脂質各種の分布および含有量に関する解析、２）細胞膜タンパク質の局在や発現量の解析、３）Lamタンパク質は細胞膜と小胞体間における輸送に関わることから両器官のMembrane Contact siteに関する解析などの研究を計画している。また、遺伝学的アプローチとしては４）高発現により致死性を抑圧する遺伝子の単離を計画している。このような解析を通じて、Lamタンパク質とリン脂質が有するステロール活性化の制御機能やその生理的意義の解明を目指す。
Sfk1の機能解析は、精製・可溶化の段階まで成功しており、プロテオリポソームの調製条件の検討を引き続き進めていく。技術的に難しく点が多いことから、課題点については人工膜の研究を専門とする研究者との共同研究を視野に入れて進める予定である。プロテオリポソームの調製条件を決定した後、脂質種の組み合わせを変えた人工膜を調製し、エルゴステロールの活性化におけるSfk1の機能を評価する予定である。
令和４年度までに得られた一遺伝子変異株をベースにしたエルゴステロール活性化を制御因子のスクリーニングは完了している。令和５年度は、Sfk1の機能解明するためにSfk1と協調して機能する遺伝子を探索する。前述の細胞膜タンパク質の変異とsfk1遺伝子の欠失変異を組み合わせた二重変異株を作成し、同様のスクリーニングを完了させる予定である。また、一遺伝子変異により影響を受けている変異株について、上述の条件致死変異株と同様の解析を進めてステロール活性化に関わる機能を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
当該年度予定していた実験及び研究活動については完了しているが、全ての業務が予算範囲内で遂行され、残預金が生じた。次年度に繰り越す残預金については、次年度の計画を加速して遂行できるように、実験に必要な物品を購入する予定である。
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