2021 Fiscal Year Research-status Report
BAR protein and N-WASP-mediated regulation of skeletal muscle fusion by cooperating with cell migration
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21K06078
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| Research Institution | Chiba University |
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Principal Investigator |
高野 和儀 千葉大学, 大学院理学研究院, 助教 (60466860)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | アクチン細胞骨格 / 筋細胞融合 / 細胞運動 / 筋原線維形成 / Cortical actin / コスタメア |
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| Outline of Annual Research Achievements |
まず始めに，筋細胞遊走と筋細胞融合の関係をさらに解析する目的で，分化過程におけるlamellipodia形成について検討した。その結果，分化過程においてlemellipodia形成率は減少するものの，細胞の一箇所に集積して生じることが明らかになった。そこで運動方向性との関係を筋細胞分化過程におけるライブセルイメージングにより解析したところ，細胞運動の速度は低下するものの，筋細胞分化過程において方向性を有する細胞運動が引き起こされる割合が上昇することが示された。
さらに，細胞膜とcortical actin bundleの動態変化と筋細胞融合との関係性を明らかにするために，細胞膜と連結されたcortical actin bundle の可視化を試みた。まず，アクチンフィラメントとの弱い親和性を有するF-tractinのアクチン結合ドメインを用いた細胞膜結合性の蛍光プローブであるPMactをC2C12細胞に安定発現するクローン(C2-PMact)を得た。C2-PMact細胞は未分化状態では通常のC2C12細胞と形態的には区別がつかなかった。しかしながら，C2-PMact細胞を分化を誘導させることにより細胞膜の柔軟性を増して丸型に近い形態となり，細胞運動が促進する一方で筋細胞融合が阻害されることを確認した。分化した筋細胞では細胞膜直下において筋原線維形成が起こり，Z線とインテグリンを結ぶコスタメア構造の存在が知られている。したがって，筋細胞分化過程におけるPMactは筋原線維形成を阻害してインテグリンの機能を抑制し，細胞-基質間接着が弱まる結果として細胞形態が丸型に変化したと考えられる。加えて，筋細胞におけるcortical actinは分化後は筋原線維-コスタメア軸が細胞-基質間接着および筋細胞融合に重要である可能性も考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
計画書に記載したような期待した結果とはならなかったが，PMactが思うようなcortical actinプローブとしての機能を果たさなかったおかげでPMact自体のアクチンダイナミクスの抑制効果などに視点を当てられることができ，さらに，筋細胞分化過程においてcortical actinの特徴が変わる可能性の示唆にまでたどり着くことができたことは順調以上の成果と考えている。
なぜなら，本研究計画で着目しているN-WASPは筋原線維形成におけるアクチン重合に関与することを我々は明らかにしており，加えてBARタンパク質とともに細胞膜の形態制御にも関与するからである。幼弱な筋原線維が分化後に細胞融合に関与することはこれまでに知られていない。したがって，研究計画書よりも一段深い次元で独自性のある研究遂行が望めると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はcortical actinが幼弱な筋原線維に変化することも想定に入れるが，アクチンの特徴は違えど，やはり細胞骨格としてのアクチンを可視化する方策には変わらない。このため，PMactではなく，細胞内アクチンフィラメントのプローブであるlifeactにおいてもC2C12細胞ですでに得られた安定発現株(C2-GFP-lifeact)を用いてアクチン動態の可視化と細胞融合への影響の評価を行う。なお，2022,2023年度の予備実験も完了しており，筋細胞分化過程は時間的に長いために Ezrin(T567D)-FKBPとFRB-CAAXを用いてラパマイシンで細胞膜局在を誘導する条件での筋細胞融合を評価することは困難であった（ラパマイシンの分解や長期的な刺激による予期せぬ作用のため）。このため，細胞膜へ移行するLyn10-tagを付加したEzrin(T567D)をTetONでtetracycline刺激依存的に発現するC2C12細胞株を得る。この細胞における筋細胞融合の評価には計画通り，fusion indexを用いる。また，追加の実験としてEzrinのリン酸化状態をcell lysateを用いたウェスタンブロッティングや免疫蛍光染色により明らかにする。ERMファミリーのノックダウンについても計画書通りに遂行する予定である。
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| Causes of Carryover |
発注した物品（プラスチック製品）の納期が当該年度に間に合わなかったため
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Research Products
(3 results)
