2021 Fiscal Year Research-status Report
糖転移酵素の基質認識のゆらぎを利用した高付加価値抗体生産細胞の構築
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21K06081
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
三崎 亮 大阪大学, 生物工学国際交流センター, 准教授 (20571186)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | CHO細胞 / 糖鎖 / 脱フコシル化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ゲノム編集技術を用いて、GDP-マンノース4,6-デヒドラターゼ（GMD）をノックアウトしたチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞（CHO-ΔGMD）を構築できた。ゲノムDNA上でGMDをコードする塩基配列に変異が導入されていることを確認した。ところが、CHO-ΔGMD細胞より全可溶性タンパク質を抽出し、高速液体クロマトグラフィーならびに質量分析器で詳細な糖鎖構造解析を行ったところ、野生型CHO細胞と比較してフコース結合型糖鎖の含量は50%の減少に留まった。この原因として、構築したCHO-ΔGMD細胞が接着細胞であり培養に血清の添加を伴うことから、血清由来のフコース含有成分が細胞内へ取り込まれ、GMDが働くde novo経路ではなくサルベージ経路を利用してGDP-フコースが合成、フコース転移酵素によって糖鎖に付加されたと考えた。そこで、当該細胞を無血清培地に馴化し浮遊化したところ、フコース結合型糖鎖を野生型の0.8%（全糖鎖の0.2%）まで抑制することに成功した。また、血清成分を用いてin vitroで糖鎖へのフコース転移が起きることを確かめた。この結果から、フコース結合型糖鎖の生合成を確実に抑制するためには血清を用いた細胞培養は得策ではなく、無血清培地へと馴化すべきであることが分かった。
また、野生型の浮遊CHO細胞の培養液中に100 mMの濃度でアラビノースを添加し培養した。培養7日後の細胞よりタンパク質を抽出し糖鎖構造を解析したところ、フコースの代わりにアラビノースが付加した糖鎖の存在を認めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本申請前より準備を進めていたこともあり、滞ることなくCHO-ΔGMD細胞を構築、細胞由来のタンパク質においてフコース結合型糖鎖の合成をほぼ抑制（野生型の0.8%）することができた。フコース結合型糖鎖の抑制が十分でない場合は、さらにGDP-フコーストランスポーターのノックアウトも必要であったが、予定よりも早い段階で今後の研究に使用するための有用宿主を樹立できた。しかも、将来的に抗体を分泌生産するため、より生産性の高い無血清培地に馴化した浮遊細胞として樹立できたことは成果と考える。
また、野生型の無血清馴化浮遊CHO細胞の培養液中にアラビノースを添加することで、フコースの代わりにアラビノースを保持する糖鎖を細胞内で生産することに成功した。添加時の終濃度は100 mMであるが、特に細胞の生育状態に影響を与えないことも分かった。実際にフコースの構造類似糖が細胞内で付加できることが証明できたため、今後、の研究がスムーズに進行できると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は、野生型CHO細胞に対しても、培養液中にフコース構造類似糖を添加することで細胞内糖鎖に当該構造類似糖を付加できることが分かったが、その付加効率が不明であるため、添加濃度を振り、質量分析器レベルで詳細な糖鎖構造を解析することで明らかにする。また、本年度樹立したCHO-ΔGMD細胞に対して、同様のフコース構造類似糖添加実験を行い、野生型への構造類似糖の付加効率と比較する。
野生型CHO細胞およびCHO-ΔGMD細胞に抗体遺伝子を導入し、抗体生産細胞を樹立する。当該細胞に対してもフコース構造類似糖を添加し、実際に抗体に付加されるかどうかを明らかにする。最終的に、フコース構造類似糖をもつ抗体を得ることができれば、Fc受容体との結合力を分析し、糖残基改変による抗体機能性への効果を明らかにする。
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