2023 Fiscal Year Annual Research Report
糖転移酵素の基質認識のゆらぎを利用した高付加価値抗体生産細胞の構築
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21K06081
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
三崎 亮 大阪大学, 生物工学国際交流センター, 准教授 (20571186)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | チャイニーズハムスター / フコース / アラビノース / 抗体 / 糖鎖 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
チャイニーズハムスター肺（CHL）細胞にて、フコースの構造類似糖であるD-アラビノースを内在性α1,6-フコース転移酵素（Fut8）を利用して細胞内N型糖鎖に付加することを目標とした。Fut8の供与体基質であるGDP-フコースの存在がGDP-アラビノースと競合することを防ぐため、まずde novo合成経路で機能するGDP-マンノース4,6-デヒドラターゼ（GMD）をゲノム編集技術を用いてノックアウトしたCHL-ΔGMD細胞を構築した。CHL-ΔGMD細胞では野生株と比較してフコース結合型（フコシル化）糖鎖が95%減少した。さらに、血清からのGDP-フコースの混入を抑制するため、無血清培地に馴化した浮遊CHL-ΔGMD細胞を樹立した。
細胞を10 mMのD-アラビノース存在下で14日間培養し、細胞より全可溶性タンパク質を抽出、N型糖鎖構造をHPLCならびに質量分析器で解析した。その結果、アラビノース結合型（アラビノシル化）糖鎖が存在すること、野生株では全アラビノシル化糖鎖量が全フコシル化糖鎖量の約4%であったのに対し、CHL-ΔGMD細胞では約3倍に増加することがわかった。これらの成果は、CHL細胞が外部より添加したD-アラビノースを基質としてサルベージ経路にて糖ヌクレオチドGDP-アラビノースを合成できること、GDP-アラビノースを供与体基質として内在性Fut8でN型糖鎖にアラビノースを転移できることを示す。
次に、ヒトIgG抗体を発現するCHL-ΔGMD細胞を構築した。当該細胞を上記の条件でアラビノース存在下で培養した。培養液から分泌IgGを精製し糖鎖構造を解析したところ、アラビノシル化糖鎖は質量分析器レベルで検出できなかった。糖鎖構造の約80%が高マンノース型という異常な分布であったため、細胞が小胞体ストレス等の負荷を受けていると考え、現在抗体生産細胞を再構中である。
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