2021 Fiscal Year Research-status Report

膵β細胞におけるガレクチンラティスの機能メカニズムの解明と病態生理学的意義の理解

Research Project

Project/Area Number	21K06082
Research Institution	Kumamoto University
Principal Investigator	大坪和明熊本大学, 大学院生命科学研究部(保), 教授 (30525457)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	糖鎖 / ガレクチンラティス / Protein kinase C / Teneurin-3
Outline of Annual Research Achievements	細胞膜を隔てた選択的輸送は、特異的トランスポーターやチャネル分子が担っているため、これら分子の機能はその発現パターンや膜局在が決定し、多くは糖タンパク質として機能する。細胞間質には糖鎖のβガラクトシド構造を特異的に認識し結合するガレクチンが存在し、細胞膜表面の糖タンパク質を架橋することで『ガレクチンラティス』という機能ドメインを形成する。これまでの研究から、膵臓β細胞においてGLUT2が自身の糖鎖を介してガレクチン９とガレクチンラティスを形成することを発見した。これにより膵臓β細胞のグルコースセンサー機能が保持され、血糖に応じたインスリン分泌が可能になることを証明した。しかしながら膵臓β細胞におけるガレクチンラティスの機能メカニズムは不明である。申請者らは膵臓β細胞の膜表面タンパク質からガレクチンラティス複合体を精製し、質量分析によりTeneurin-3を同定した。Teneurin-3はβガラクトシド構造を有する多分岐型の複合型N型糖鎖を有することが判明した。Teneurin-3は多くのN型糖鎖を有し、細胞骨格と直接相互作用することから、ガレクチンラティスのアンカー分子の候補分子であると推察された。現在、マウス膵臓ベータ細胞株において、CRISPR-Cas9システムによりTeneurin-3遺伝子のノックアウト細胞を作成している。膵臓ベータ細胞培養上清中にラクトースを添加することで、ガレクチンラティスを競合的に破壊すると、GLUT2やCAT3がエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれることを見出した。そのメカニズムを解明するため、膵臓ベータ細胞培養系を用いてPKC阻害剤処理を行なった結果、ガレクチンラティスの崩壊がPKCを活性化させ、膜タンパク質のエンドサイトーシスを惹起していることを示唆する結果を得た。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 申請者らは膵臓β細胞の膜表面タンパク質を架橋し、ガレクチンラティス複合体を免疫沈降により精製し、質量分析によりガレクチンラティスの構成分子の探索を行なった。その結果、分子量300KDaの膜タンパク質でN型糖鎖付加部位を細胞外ドメインに17ヶ所有し、細胞内ドメインにアクチン結合活性を有するTeneurin-3が同定された。Teneurin-3は膵臓ベータ細胞において多分岐型の複合型N型糖鎖を有し、βガラクトシド構造を有することがレクチンブロットによる解析から判明した。従前の我々の結果から、細胞膜表面において糖鎖を介してガレクチンラティスの形成の主軸となり、膜タンパク質の安定化に寄与するアンカー分子の存在が想定されたが、Teneurin-3は多くのN型糖鎖を有し、細胞骨格と直接相互作用することから、ガレクチンラティスのアンカー分子の候補分子であると推察された。現在、マウス膵臓ベータ細胞株において、CRISPR-Cas9システムによりTeneurin-3遺伝子のノックアウト細胞を作成している。これまでの研究から、膵臓ベータ細胞培養上清中にラクトースを添加することで、ガレクチンラティスを競合的に破壊すると、輸送体分子であるGLUT2やCAT3がエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれることを見出してきた。しかしながら、そのメカニズムは全く不明であった。一方、一般的に細胞膜タンパク質のエンドサイトーシスがProtein kinase C (PKC)を介して進行することが報告されている。そこで、膵臓ベータ細胞培養系を用いてPKC阻害剤処理を行なった結果、ガレクチンラティスの破壊によるGLUT2のエンドサイトーシスが抑制されるという結果を得た。この結果は、ガレクチンラティスの崩壊がPKCを活性化させ、膜タンパク質のエンドサイトーシスを惹起していることを示唆している。
Strategy for Future Research Activity	ガレクチンラティス形成におけるTeneurin-3の関与を解析するため、今後樹立するTeneurin-3欠損膵臓ベータ細胞表面におけるガレクチンラティス形成、GLUT2やCAT3の膜マイクロドメイン局在と発現レベル解析、細胞表面での分子寿命、輸送活性測定を行う。また、ガレクチンラティスの崩壊がPKCを活性化するメカニズムを明らかにするため、Teneurin-3欠損膵臓ベータ細胞およびコントロール細胞におけるガレクチンラティス構成分子を比較し、シグナルの起点をなる分子を探索する。加えて、両細胞内のシグナル伝達経路の詳細を解析するため、抗体アレイ解析およびマイクロアレイ解析を行う。変化が見られた分子に関して、オントロジー解析を実施し、ガレクチンラティスの機能や崩壊により惹起されるエンドサイトーシスに関連するシグナル伝達経路に関する情報を取得する。