2023 Fiscal Year Annual Research Report
心疾患に関連する新奇生理活性物質 D-グルタミン酸の分解酵素に関する研究
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21K06085
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
片根 真澄 北里大学, 薬学部, 准教授 (90383653)
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2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | D-グルタミン酸シクラーゼ / D-グルタミン酸分解酵素 / D-グルタミン酸 / 5-オキソ-D-プロリン / 比色定量法 / D-アミノ酸 / 心臓 / 心不全 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、遊離の D-グルタミン酸（D-Glu）の分解酵素として最近同定した、哺乳類 D-Glu シクラーゼ（DGLUCY；D-Glu を 5-オキソ-D-プロリンと水に分解する反応を可逆的に触媒する酵素）の代謝機構の全貌を解明することである。
2021 年度および 2022 年度には、DGLUCY 活性の測定法に関する研究を進め、吸光度計を用いた比色定量に基づく迅速で簡便な DGLUCY 活性の新規測定法を開発した。すなわち、5-オキソ-D-プロリンの 2-ニトロフェニルヒドラジン塩酸塩による誘導体化反応の最適な条件を決定した。また、比色定量法を用いてマウス組換え DGLUCY の D-Glu に対する動力学定数を決定し、本法を用いて DGLUCY の酵素活性を正確に測定できることを明らかにした。さらに、野生型および DGLUCY ノックアウトマウスそれぞれから樹立した培養細胞株の抽出液を酵素源として DGLUCY 活性を測定し、比色定量法を用いて細胞可溶化液中における DGLUCY の酵素活性を正確に測定できることを明らかにした。
2023 年度には、C 末端に His タグが付加された、マウス DGLUCY の N 末側領域のみ、および C 末側領域のみを発現する大腸菌を用いて、DGLUCY の構造機能相関に関する研究を進めた。定法に従って大腸菌を培養し、超音波処理により菌体を破砕した。得られた crude extract に含まれる組換えタンパク質を、Ni カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。その結果、N 末側領域はほぼ単一の状態で精製される一方で、C 末側領域は様々な培養条件においても crude extract に回収されないことが明らかになった。今後、His タグの位置をN 末端に変更して同様の解析を進める予定である。
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