2022 Fiscal Year Research-status Report
エンドサイトーシス経路を基軸とした細胞内輸送経路の解明
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21K06087
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| Research Institution | Tokyo University of Technology |
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Principal Investigator |
十島 純子 東京工科大学, 医療保健学部, 教授 (00431552)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
十島 二朗 東京理科大学, 先進工学部生命システム工学科, 教授 (00333831)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | エンドサイトーシス / 細胞内輸送 / エンドソーム / TGN |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は以下の研究を実施した。
（1）クラスリン小胞の初期エンドソームへの融合機構の解明、についてはラパマイシン誘導ヘテロ二量化を用いたPan1pの異所性発現の影響について実験を進めた。本年度の研究ではアクチン活性化因子や脱重合因子もPan1繋留部位に順番にリクルートされ、ここでエンドサイトーシス過程の後期過程が再現されることを明らかにした。さらに、クラスリン小胞のエンドソームへの輸送に必要なアクチンケーブルもPan1繋留部位に繋留されることを明らかにした。
(2) ゴルジ体由来小胞とエンドソームの融合機構、についてはゴルジ体からの輸送経路を遮断した際のクラスリン小胞-エンドソーム間の融合に与える影響について、クラスリンアダプタータンパク質であるGGA2の機能ドメインを部分的に欠損する変異体を作成し、エンドサイトーシス経路の輸送への影響を調べた。その結果、他のクラスリンアダプタータンパク質との結合を仲介するGAEドメイン欠損体では、野生型や他のドメイン欠損体と比べて顕著なエンドサイトーシスの異常が見られた。また、リサイクル経路のマーカーであるSnc1p(R-SNARE)の局在を詳細に調べたところ、蛍光α-factorと同様にトランスゴルジ網内のTlg2pが局在する区画と共局在することが分かった。さらに、GGAs欠損体ではSnc1pはTlg2pと共にSec7pとは異なる部位に蓄積することが分かった。
(３)エンドソームにおける積荷の分解とリサイクリングの選別機構、については脂質膜成分であるフォスファチジルセリン（PS）合成酵素の欠損体（cho1Δ）の解析を行った。その結果、cho1ΔではPSが著しく低下し蛍光α-factorの取り込み低下が見られた。これはα-factorの受容体であるSte2pの細胞膜局在の低下が原因であることを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
エンドサイトーシスは様々な細胞外の物質を細胞内へと取り込む機構で、栄養物質の摂取、免疫応答機構、病原体の細胞内への感染など多くの生命現象に関与している。以前の研究で、研究代表者らは出芽酵母の受容体仲介型エンドサイトーシスを可視化する蛍光エンドサイトーシスマーカーの開発に成功し、そのマーカーを用いたエンドサイトーシス関連遺伝子の網羅的なスクリーニングを行なった。その結果、エンドサイトーシスの輸送経路に異常のある多数の出芽酵母変異体の単離に成功した。本研究ではスクリーニングにより得られた変異体の詳細な解析を通して、エンドサイトーシス経路におけるエンドソームの形成、成熟を中心とした細胞内輸送経路の全体像を明らかにすることを目的とし、（1）クラスリン小胞の初期エンドソームへの融合機構の解明、（２）ゴルジ体由来小胞とエンドソームの融合機構、(3)エンドソームにおける積荷の分解とリサイクリングの選別機構、の3つのプロジェクを実施している。
本年度は、3つのプロジェクトそれぞれについて研究を進め、その結果の一部について論文を執筆し投稿した。投稿した論文への査読結果に対して、それぞれ追加実験等を行った。2つの論文はその後受理され、1つの論文に関しては追加実験を含む論文を再投稿中である。
以上の通り、研究は概ね順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究課題(1)については、クラスリン小胞がアクチン骨格の上を輸送されるメカニズムについて明らかにしていく。前年度の研究で、Pan1をペルオキシソームへ係留することでアクチンケーブルもリクルートされることが分かった。そこで、アクチンケーブルがPan1複合体の部位にリクルートされるメカニズムを明らかにし、クラスリン小胞とアクチンケーブルを繋留する因子を目指す。またラパマイシン誘導ヘテロ二量化を用いてアクチンケーブルの形成を異所性に誘導することを試みる。また、ペルオキシソームに係留させたPan1複合体を用いて、アクチン重合因子であるLas17p, Myo3p, Myo5pについて過剰発現や多重係留を行い、その時のアクチン重合の割合を比較する。これにより細胞内のエンドサイトーシス部位で、アクチン重合がどのようなバランスで調節されているかを明らかにする。
研究課題(２)については、GGA2のドメイン欠損変異体を用いて、ゴルジ体内での輸送や、Snc1pの局在などを調べる。これにより、GGAs遺伝子欠損において、蛍光α-factorやSnc1pの局在異常が起きる理由を明らかにする。また、ゴルジ体・TGN局在タンパク質がGGA欠損体においてどのような時空間的影響を受けるかについては、引き続き調べていく。また、クラスリンアダプタータンパク質の多重変異体を用いて、Rab5の活性がどのような影響を受けるかを調べる。
研究課題 (３)については、研究課題(1)と合わせて、エンドサイトーシスの積荷の分解とリサイクリング経路の選別がどのように起こるかについて明らかにする。
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| Causes of Carryover |
本年度分の予算は予定通り使用したが、前年度の未使用研究費が本年度は使用しきれず、残額が発生してしまった。本年度はCovid-19に伴う学内での研究制限は概ね解除されたが、Covid-19以前のレベルには戻っておらず、試薬や器具などの消耗品の支出が予定していたより少なくなったことが理由だと思われる。また、論文を3つ投稿しため、その査読結果に対する追加実験を行った期間が多く、新たな実験系や細胞株の作製が予定よりも少なかったことも理由として挙げられる。これらの研究費は来年度以降の研究で使用する予定である。また、2023年度は国内外の学会で研究成果を発表する予定であり、これらの参加費や旅費として使用する。
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[Journal Article] Pan1p, yeast Eps15, serves as a master regulator of the late stages of the endocytic pathway2022
Author(s)
Mariko Enshoji, Yoshiko Miyano, Nao Yoshida, Makoto Nagano, Minami Watanabe, Mayumi Kunihiro, Daria E. Siekhaus, Junko Y. Toshima, and Jiro Toshima
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Journal Title
J. Cell Biol.
Volume: 10
Pages: 1-10
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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