炎症性疾患に関連する硫酸化糖鎖の生合成制御機構と生物学的意義

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K06089
• Research Institution: Kobe Pharmaceutical University
• Principal Investigator: 灘中 里美 神戸薬科大学, 薬学部, 准教授 (60378578)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: プロテオグリカン / グリコサミノグリカン / 炎症

Outline of Annual Research Achievements

がん抑制遺伝子(EXT)ファミリーに属するEXT-like 2 (EXTL2)遺伝子は, 硫酸化グリコサミノグリカン(GAG)の合成を負に調節する. 申請者らは, EXTL2によるGAGの生合成調節機構が働かない場合, 炎症に関連した病態が重篤に現れること, 発生過程で神経前駆細胞の増殖が亢進することを見出しており, EXTL2は炎症を誘発する活性や神経前駆細胞の増殖を促す活性をもつGAG鎖の合成を制御すると考えている. 本研究では, EXTL2によるGAGの生合成調節機構の仕組みとその生物学的意義の解明を目指す. 2023年度は、EXTL2の発現制御機構について調べた. EXTL2遺伝子の5’非翻訳領域に結合する転写因子のうち, 炎症に関連するものを検索した. このうち, 炎症に関連する遺伝子やがん関連遺伝子を制御する転写因子CTCFに着目した. マクロファージ系株化細胞をリポ多糖で処理し, CTCF と EXTL2の遺伝子発現が調べたところ, 両遺伝子ともに炎症反応の活性化に伴い低下した. CTCFが EXTL2遺伝子の転写に関与する可能性が示唆された. CTCFの過剰発現は EXTL2遺伝子の発現を上昇させた. 次に, EXTL2遺伝子の5’非翻訳領域をクローニングし, ルシフェラーゼ遺伝子の上流に組み込んだレポーターベクターを構築した. これを用いてレポーターアッセイを行ったところ, 転写領域から-1.9 kbから-3.4 kb のDNA領域がEXTL2遺伝子の転写に関わる可能性が示唆された. また, このDNA領域を組み込んだレポーターベクターは, 発現させたCTCFによりレポーター活性が上昇した. このDNA領域にCTCFが結合し, 炎症刺激により結合が減少するかどうかを CUT-Tag法により調べた. 未刺激では, レポーターアッセイで決めた領域にCTCFの結合が認められ, LPS刺激によりこの結合が減少した. これらの結果から, 炎症反応に伴う CTCF の発現低下がEXTL2遺伝子の発現を低下させる可能性が示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

2023年度, 候補因子としたCTCFが, 定常状態ではEXTL2遺伝子の上流に結合し, この結合が炎症時に減少することが確認できたため.

Strategy for Future Research Activity

EXTL2遺伝子がCTCFの標的であることを確認するために, CTCF のノックダウンによりEXTL2の発現が低下するかを調べる.また, CTCFがEXTL2の発現制御を介して炎症性糖鎖の合成を制御しているかどうかを確認するために, 糖鎖解析を行った後, これらの結果を論文としてまとめていく.

Causes of Carryover

EXTL2遺伝子の制御に関わる候補分子が当たってくるまで, データベースや文献検索などを利用して, できるだけ費用が発生しないよう工夫した. 本年度の研究により, 候補となる転写因子が見つかったため, 最終年ではこれを証明するために経費を使用させていただく.

Research Products

• [Journal Article] Chondroitin Sulfate Proteoglycan Promotes APRIL-induced Tumor Cell Proliferation. (2024)
  • Author(s): Nadanaka, S., Koike, T., and Kitagawa, H.
  • Journal Title: Proteoglycan Res. Volume: 2 Pages: e15
  • DOI: 10.1002/pgr2.15
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Influences of amino-terminal modifications on amyloid fibril formation of human serum amyloid A. (2023)
  • Author(s): Tanaka, M., Takarada, T., Nadanaka, S., Kojima, R., Hosoi, K., Machiba, Y., Kitagawa, H., and Yamada, T.
  • Journal Title: Arch. Biochem. Biophys. Volume: 742 Pages: 109615
  • DOI: 10.1016/j.abb.2023.109615
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] EXTL2-related glycosaminoglycan biosynthesis and disease. (2023)
  • Author(s): Nadanaka, S., and Kitagawa, H.
  • Journal Title: Trends Glycosci. Glycotechnol. Volume: 35 Pages: E1-E5
  • DOI: 10.4052/tigg.2201.1E
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Synthesis of biotinylated chondroitin sulfate DA and AD tetrasaccharides composed of hetero-type disaccharide units, and their interactions with the mAb MO-225. (2023)
  • Author(s): Uemura, A., Nadanaka, S., Kitagawa, H., and Tamura, J.
  • Journal Title: Bioorg. Med. Chem. Volume: 81 Pages: 117191
  • DOI: 10.1016/j.bmc.2023.117191
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Chondroitin Sulfate Controls the Invasive Property of the Triple-Negative Breast Cancer Cell Lines, BT-549 and MDA-MB-231 Cells (2023)
  • Author(s): Satomi Nadanaka, Jun-ichi Tamura, and Hiroshi Kitagawa
  • Organizer: GLYCO26
  • Int'l Joint Research
• [Book] Glycosignals in Cancer (Insights into the role of chondroitin sulfate in cancer.) (2023)
  • Author(s): Nadanaka, S., and Kitagawa, H.
  • Total Pages: 238
  • Publisher: Springer
  • ISBN: 978-981-19-7734-3
• [Remarks] 神戸薬科大学生化学研究室
  • URL: https://www.kobepharma-u.ac.jp/edrs/faculty_member_list/biochemistry.html
• [Remarks] 神戸薬科大学生化学研究室（オリジナルページ）
  • URL: http://kpubiochem.firebird.jp/