2022 Fiscal Year Research-status Report
Functional characterization of novel P-type ATPAses potentially associated with lysosomal proteolysis
| Project/Area Number |
21K06090
|
|---|
| Research Institution | Yasuda Women's University |
|---|
Principal Investigator |
羽鳥 勇太 安田女子大学, 薬学部, 講師 (00759730)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
|
| Keywords | ミトコンドリア / オートファジー / リソソーム / パーキンソン病 / P5-ATPase / P型イオンポンプ / マイトファジー |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
2021年度・2022年度を通じて、組換えアデノウイルスを用いたP5-ATPaseの発現系の構築を進め、酵素活性の保持と高収量を達成した。2021年度は局在解析を中心として実験を実施し、共焦点顕微鏡下でライブセルイメージングによりオルガネラ動態とATP13A2（およびATP13A3）分子の挙動の比較解析を行った。その結果、ATP13A2分子の発現によりミトコンドリア外膜タンパク質であるTom20が、ミトコンドリアからオートファジー経路へとリクルートされるとの新たな発見が得られた。2022年度には、Tom20を始めとしたミトコンドリアタンパク質との相互作用の検討を進め、その成果をPLOS One誌に発表した（PLoS One. 17, e0276823, 2022）。
2022年度の成果として、ATP13A2を大量発現して得られた膜画分を用い、ATPase活性を指標として新規の輸送基質の探索を進めた。その結果、これまでに特定されているポリアミン類（スペルミン、スペルミジン、プトレッシン）に加え、複数のモノアミンまたはその前駆体でもATPase活性が惹起されるとの新たな知見を見出した。組換えアデノウイルスの利点を活かし、リポフェクション法では高効率の遺伝子導入が困難な細胞株でも大量発現を試み、SH-SY5Y（ヒト神経芽種由来）からATP13A2含有膜画分を単離することに成功した。現在、神経芽腫由来の膜画分を用い、モノアミン類とその前駆体を中心に、輸送基質の特定を進めている。この新しい成果の一部は、日本薬学会第143年会にて発表済であり、さらに詳細なデータを収集した後、年度内に学術論文として報告する予定である。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
アデノウイルスを用いたATP13A2分子の大量発現については、当初、Haloタグを付加したコンストラクトの作成を旧来のAdEasy-1ベクターを利用して試みたが、空ウイルス粒子の混入など、当初の予想に反して実験が難航した。2022年度より、ベクター系を変更して発現系を再構築し、その問題は完全に解決され、他の報告例にも類をみないレベルの高収量が達成された。
|
| Strategy for Future Research Activity |
ATP13A2の輸送基質の探索に関しては、PLOS One誌に報告したとおり、ミトコンドリア品質管理とオートファジーとの関連が確認されたことで、その方向性が定まってきた。一方、ATP13A2発現膜画分を用いた生化学的解析からは、モノアミン類の輸送に関与する可能性が示唆され、ATP13A2の新たな機能の発見につながる可能性がみえている。その機能が、オートファジーとどのような関連を持つのか、今後、生化学的解析と細胞生理学的解析を並行して進めることで明らかにしていきたい。
|
| Causes of Carryover |
予定していた学会集会参加がコロナ禍の影響でオンライン方式での参加となり、当初旅費として計上していた分、次年度使用額が生じることとなった。次年度、集会参加等、成果の発信に要する経費として使用する計画である。
|
