2022 Fiscal Year Research-status Report

The interrelationship between oligomer formation, DNA unwinding, and ATPase of a helicase studied using mutants lacking its C-terminal amino acids

Research Project

Project/Area Number	21K06103
Research Institution	The Graduate School for the Creation of New Photonics Industries
Principal Investigator	横田浩章光産業創成大学院大学, 光産業創成研究科, 准教授 (90415547)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	１分子計測 / ナノバイオ / 核酸 / 酵素反応
Outline of Annual Research Achievements	多くのタンパク質で見られる多量体形成は、タンパク質の活性制御などに重要な役割を果たす。研究代表者は非六量体型スーパーファミリー1ヘリカーゼUvrD のC末端アミノ酸欠失変異体が、野生型に比べて多量体を形成しづらいことを明らかにした。一方、その多量体構造は報告されておらず、多量体を構成する個々のUvrDがどのような相互作用を経て、ATP加水分解エネルギーを使いDNA巻き戻しをしているのかは不明である。そこで本研究ではUvrDのDNA巻き戻し機能に関わる多量体形成に重要なC末端アミノ酸に注目し、UvrDの多量体構造・DNA巻き戻し機能・ATPの結合解離（ATPase）の相関関係を蛍光1分子イメージングで明らかにする。そしてこれまで明らかにするのが困難だったタンパク質の多量体形成とそれによる機能発現の間のブラックボックスに迫ることを目指している。研究代表者は、多量体を形成できないとされるC末端40アミノ酸欠損変異体（UvrDΔ40C）が定説に反し、二量体あるいは三量体でDNAを巻き戻していることを明らかにしている（Biophysical Journal (2020)、生物物理 (2021)、Biophysics and Physicobiology (2022)）。 2022年度は、UvrD のC末端アミノ酸の多量体形成への役割をさらに理解するために、ヘリカーゼスーパーファミリーで保存されているサブドメイン外にあるC末端アミノ酸すべてを欠失させた変異体のDNA巻き戻し過程の解析を進め、UvrD－DNA間の結合・解離速度定数を得た。また、UvrDのサブドメインの特定サイトの特異的蛍光標識、UvrD多量体構造の蛍光1分子イメージング、ゼロモード導波路による高濃度蛍光性ATP条件下の蛍光1分子イメージング、DNA巻き戻しの1塩基分解能観察に取り組んだ。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ヘリカーゼスーパーファミリーで保存されているサブドメイン外にあるC末端アミノ酸すべてを欠失させた変異体のDNA巻き戻し過程の解析により得たUvrD－DNA間の結合・解離速度定数より、C末端アミノ酸の多量体形成の役割の理解を深めることができた。また、サブドメインの特定サイトを特異的に蛍光標識したUvrDを用いてUvrD多量体構造の蛍光1分子イメージングを行った。さらに、ゼロモード導波路による高濃度蛍光性ATP条件下の蛍光1分子イメージング、DNA巻き戻しの1塩基分解能観察に取り組んだ。
Strategy for Future Research Activity	ヘリカーゼスーパーファミリーで保存されているサブドメイン外にあるC末端アミノ酸すべてを欠失させた変異体のDNA巻き戻し過程の蛍光1分子イメージングの解析とUvrD多量体構造の蛍光1分子イメージングを継続する。また、ゼロモード導波路による高濃度蛍光性ATP条件下の蛍光1分子イメージングとDNA巻き戻しの1塩基分解能観察については、観察系を工夫しつつ観察対象をC末端アミノ酸欠損変異体へ対象を広げる。
Causes of Carryover	2022年度は前年度までに準備していた試料を用いての研究が多くを占め、当初計画より消耗品の購入が少なかったため、次年度使用額が生じた。今後は研究計画にそって使用する。