2021 Fiscal Year Research-status Report
Ensemble structure determination using multiple measurement data in solution state
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21K06114
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan University |
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Principal Investigator |
池谷 鉄兵 東京都立大学, 理学研究科, 准教授 (30457840)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | NMR / 立体構造決定 / アンサンブル構造 / 常磁性効果 / マルチドメイン蛋白質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は，一昨年度開発したmulti-state蛋白質立体構造計算法のマルチドメイン蛋白質への応用研究を開始した．Multi-state蛋白質立体構造計算法は，複数の異なるNMRデータを統合し，複数状態を仮定して構造解析を行うことで，多形構造をとる蛋白質の個々の状態の構造を同時に決定することができる手法である．モデルタンパク質として，直鎖ダイユビキチン，FixJおよびGRB2蛋白質を選択した．それぞれの蛋白質について13C/15Nおよび2H/13C/15N試料を作製し，3次元三重共鳴スペクトルを測定して，蛋白質主鎖と側鎖の共鳴シグナルの帰属を行った．3D NOESY測定から短距離の距離情報の取得も行った．また，それぞれの蛋白質の個々のドメインに常磁性金属配位タグを結合させ，常磁性効果の疑似コンタクトシフト(PCS)と常磁性緩和効果(PRE)データの取得に成功した．これらのデータをもとにmulti-state構造計算を行い，これまでにマルチドメイン蛋白質の大まかなドメイン配向の決定をすることができた．今後は，さらに複数箇所に常磁性金属を配位させ，常磁性効果を測定するとともに，残余双極子相互作用(RDC)など別のデータの取得も試みることで，より高い精度の構造決定を目指す．
KRasとRGL2の相互作用解析では，NMR滴定実験により異なるモードで複合体を形成していることが示唆された．また，X線結晶構造解析により，KRas-RGL2複合体の立体構造決定にも成功した．これらの成果は，科学専門誌に発表するため，現在原稿を作成中である．加えて，今後は，NMR緩和実験などにより，結合に関わるダイナミクスも明らかにしていく．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は，一昨年度開発したmulti-state立体構造計算法をマルチドメイン蛋白質へ応用することが目的であった．複数のマルチドメイン蛋白質についてNMR常磁性効果を測定して，大まかな構造決定までは達成した．一方で，いくつかの試料については，データ数がまだ不十分で，十分な精度の構造を得られていないため，今後は蛋白質の複数箇所に常磁性金属を導入し，距離・角度情報をさらに増やす必要がある．具体的には，直鎖ダイユビキチンについては，溶液中でのデータはほぼ測定が終わっているものの，最終目標は細胞内環境でのドメイン配向決定であるため，現在細胞内で常磁性効果を計測するための条件検討を進めている． GRB2タンパク質については，NOE, PRE，RDCデータをもとにmulti-state立体構造計算を行いアンサンブル構造を得ることに成功している．SAXSの測定データと共同研究で進めている分子動力学シミュレーションの結果と合わせ，現在最終的な結果のまとめを進めている．次年度には科学専門誌に論文投稿の準備を開始できる予定である．また，GRB2は，SOS1のプロリンモチーフ領域と相互作用することで，液液相分離(LLPS)を引き起こすことも本年度の研究で見出した．これまで，GRB2のLLPS形成にはLAT蛋白質など，さらにもう一種類の蛋白質との相互作用が必要と考えられてきたが，GRB2とSOS1だけでもLLPS形成することを発見できたのは，当初の想像を超えた進展であった．現在，このLLPS形成の最適条件の検証を進めている．FixJについては，常磁性金属を配位箇所にシステインを導入する必要があるが，システイン変異により蛋白質が不安定化する傾向が見られ，当初予定より進捗が遅れている．
以上より，当初計画よりもやや遅れているプロジェクトはいくつかあるものの，全体としては概ね研究計画通りに進行中である．
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は，複数のマルチドメイン蛋白質についてNMR常磁性効果を測定して，大まかな構造決定までは達成した．一方で，FixJ蛋白質などは，データ数がまだ不十分で，十分な精度の構造を得るには至っていない．より高い精度の構造を得るために，蛋白質の複数箇所に常磁性金属を導入し，距離・角度情報をさらに増やす必要がある．一方で，FixJは，特定部位にシステイン変異を導入すると蛋白質が不安定化する傾向も見られたため，最適な変異サイトの検討と，システイン変異を必要としないRDCなどの測定も行い，ドメイン配向に関する構造情報を増やしていく．マルチドメイン蛋白質の解析では，X線小角散乱(SAXS)などの別の測定法も行い，NMRで得られた溶液中のアンサンブル構造の検証も進めていく予定である．さらに，直鎖ダイユビキチンなどのプロジェクトでは，細胞内でのドメイン配向決定が到達目標の１つであるため，今後は細胞内での常磁性効果を測定できる条件を検討していく．
新規プログラム開発のプロジェクトでは，我々は，ベイズ推定を用いた立体構造計算法と，multi-state立体構造計算法を別々に開発しているが，今後はこの2つを手法を統合する方向に拡張する．この手法を，複数のシミュレーションデータと実測データに適用し，従来法と性能比較を行うことで，本手法の有効性を検証していく予定である．
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| Causes of Carryover |
コロナ禍と東京都立大の火災により，実験を数か月中断することになったため．繰り越した予算は，実験試薬等の消耗品の購入に充てる予定である．
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Research Products
(17 results)
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[Presentation] Multi-state structure determination and dynamics analysis reveals a new ubiquitin-recognition mechanism in yeast ubiquitin C-terminal hydrolase2021
Author(s)
T. Ikeya, M. Okada, Y. Tateishi, E. Nojiri, T. Mikawa, S. Rajesh, H. Ogasa, T. Ueda, H. Yagi, T. Kohno, T. Kigawa, I. Shimada, P. Guentert & Yutaka Ito
Organizer
22nd International Society of Magnetic Resonance Conference (ISMAR), the 9th Asia-Pacific NMR (APNMR) Symposium
Int'l Joint Research
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