Study of temperature resistant mechanisms of papain enzymes by single-molecule measurements

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K06115
• Research Institution: Tokyo University of Science
• Principal Investigator: 梅村 和夫 東京理科大学, 理学部第二部物理学科, 教授 (60281664)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: １分子計測 / 酵素 / パパイン / 耐熱性 / 原子間力顕微鏡 / カーボンナノチューブ / 近赤外分光 / デジタルホログラフィック顕微鏡

Outline of Annual Research Achievements

酵素パパインの耐熱メカニズムを1分子計測により明らかにすること、そのための手段として単層カーボンナノチューブ（SWNT）を用いて酵素反応を検知することが本研究の狙いである。研究初年度は液中原子間力顕微鏡（AFM）測定を中心とし、近赤外顕微鏡および近赤外発光スペクトル測定も併用してDNAで水溶液分散したSWNT（DNA-SWNT）とパパイン分子との複合体や混合物の構造・挙動を評価した。試料の注入手順などを最適化することによりAFM測定によってパパインとDNA-SWNTの相互作用のpH依存性などを1分子レベルで評価できた。この実験からDNA-SWNTとパパインの相互作用がpHによって大きく変化することが明らかになった。今後はさらに、基質を添加しての酵素反応の液中AFM測定やフォースカーブ測定へと進める予定である。1分子測定をサポートする巨視的な測定として同様な試料の溶液状態での近赤外発光などのスペクトル測定を行い、パパイン分子の吸着をSWNTの発光で検知することができた。汎用のキュベットを用いた測定のほかに、基板上に作製した窪みに試料を入れることで微量での測定も試みた。このほか、ホログラフィック顕微鏡および近赤外顕微鏡測定に適した試料の作製条件の検討を行った。これらは細胞レベルでの観察実験をゴールとするため、パパイン分子をミクロンサイズのシリカに吸着させた場合、あるいは直接細胞に投与した場合の酵素反応実験を試みた。この観察実験では、今のところ従来的な色素を用いて酵素活性を評価しているが、今後はこれをSWNTによる検出へと展開したい。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

巨視的な測定では高温での酵素反応実験を行っているが、AFMによる1分子実験では高温での測定条件がまた整わず、室温での実験にとどまった。高温での測定が安定にできるよう試料条件を検討している。

Strategy for Future Research Activity

1分子でのパパインおよびDNA-SWNTの水溶液中AFM測定が安定にできるようになってきたため、高温での測定、および基質を添加しての酵素反応の測定に進む。巨視的な測定ではSWNTの発光を用いた酵素反応の検知を実現したい。そのための工夫としてミクロンサイズの土台の使用を考えている。以上については、今年度中に学会発表と論文投稿を予定している。ホログラフィック顕微鏡および近赤外顕微鏡による細胞レベルの観察実験に関しては、なお予備実験が必要である。