2021 Fiscal Year Research-status Report
Roles and their molecular mechanisms of replication barrier zones programmed on chromosome for genome stability maintenance
| Project/Area Number |
21K06120
|
|---|
| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
|---|
Principal Investigator |
秋山 昌広 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 准教授 (80273837)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
末次 正幸 立教大学, 理学部, 教授 (00363341)
日詰 光治 埼玉医科大学, 医学部, 講師 (10378846)
大島 拓 富山県立大学, 工学部, 准教授 (50346318)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
|
| Keywords | 複製阻害 / 複製ストレス / ヌクレオチド欠乏 / チミン飢餓死 / ゲノム不安定化 / 染色体構造 / 人工染色体 / 染色体構造タンパク質 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
チミン飢餓はDNA複製を阻害し、真核生物でも微生物でも、細胞が生存力を消失する「チミン飢餓死」を生じる。医療現場で使われている抗がん剤5-FUや抗菌剤ST合剤は、チミン合成を阻害してこのチミン飢餓死を誘導する。しかし、染色体上の複製フォークの動態は、微生物でも真核生物でもゲノムワイドなレベルで明らかでないため、チミン飢餓死の機構は、その発見から60年以上たっても謎のままである。それは、チミン合成の阻害によってチミン飢餓死を誘導する抗がん剤や抗菌剤の改善や発展を妨げている。
研究代表者は、チミジン不足状態の大腸菌の複製フォークが、複製開始点oriCの両側近傍に位置する約200kbのゲノム領域（複製遅延領域FTZ: Fork Trapping Zone）で進行阻害されること、および、そのFTZ領域はチミン飢餓死で消失するゲノムDNA領域と一致することを見出した。ところが、現在のDNA複製の概念では、ヌクレオチド欠乏による複製フォークの進行阻害はゲノムのどの位置でもランダムに起きて、それがゲノムの不安定化に繋がるはずである。このFTZに選択的な複製阻害とゲノム不安定化は、単純なチミン不足による複製阻害だけで説明できない。
本研究では、(1) FTZを持つ人工染色体のセルフリー複製系での解析や、（2）FTZ領域をゲノムから欠失させた大腸菌の解析によって、「ヌクレオチド不足時に、FTZで複製フォークの進行を阻害する仕組みと、その役割は何か」というオリジナルな問いに対する答えを明らかにする。それによって、現在のDNA複製の概念では説明できないチミン飢餓での複製阻害とゲノム不安定化のメカニズムの解明を目指す。
2021年度は、FTZのコア領域50kbを含む人工染色体を構築できた。さらに、大腸菌の複製タンパク質を用いて、この人工染色体を試験管内でセルフリー複製することができた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
2021年度は以下の二つの結果を得た。（1）大腸菌の複製阻害領域FTZを持つ人工染色体をオリシロ-DNA連結法（OriCiro DNA Assembly）で構築した。当初、この方法で、複製開始点oriCの左側に位置する約200kb のFTZ全体(Left-FTZ: L-FTZ)を持つL-FTZ人工染色体の構築を目指した。しかし、L-FTZ人工染色体の作製は困難であった。そこで、L-FTZの中で複製阻害活性の特に強いゲノム領域（53 kbのL-FTZコア領域）を持つ人工染色体（L-FTZコア人工染色体）を、オリシロ-DNA連結法で構築した。この人工染色体には、L-FTZコア領域以外に、大腸菌の複製開始点oriC、染色体分配機構の遺伝子sopABC、および、テトラサイクリン耐性遺伝子を組み込んだ。（2）このL-FTZコア人工染色体を、大腸菌の20種類以上の複製タンパク質を用いるオリシロ-DNA増幅法（OriCiro DNA Amplification）によって、試験管内でセルフリー複製することができた。当初、この後に、次世代シークエンサーや原子間力顕微鏡(AFM)を用いて、人工染色体のセルフリー複製産物を塩基レベル、および、DNA高次構造レベルで解析して、FTZでの複製フォーク動態を解明する予定であった。しかし、人工染色体の構築に想定以上の時間を要したため、FTZでの複製フォークの動態解析まで行うことはできなかった。そのため、進捗状況は、やや遅れていると判断した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
1．大腸菌の20種類以上の複製タンパク質を用いてL-FTZコア人工染色体をセルフリー複製し、複製酵素以外の他のタンパク質の影響を排除して、FTZでの複製フォークの動態を明らかにする。
① 人工染色体の複製フォークの動態解析：L-FTZコア人工染色体をヌクレオチド不足条件でセルフリー複製し、次世代シークエンサを用いるND-seq法で複製フォーク動態を解析する。この解析が順調に進めば、L-FTZコア人工染色体に染色体タンパク質H-NSを結合させて、同様に解析する。研究分担者の大島と共同でこれらの解析を行い、FTZでの複製フォーク動態におけるヌクレオチド不足の影響と、H-NSの働きを明らかにする。
② 人工染色体の構造解析：L-FTZコア人工染色体のセルフリー複製産物を、真核生物と同じ方法で精製・濃縮して、原子間力顕微鏡(AFM)でDNA構造を観察できるかを検討する。予想どおりに複製フォークを観察できれば、H-NSを結合させたL-FTZコア人工染色体のセルフリー複製産物を用いて、複製フォーク進行の阻害に働くH-NS染色体構造を明らかにする。これらの解析は、研究分担者の日詰と共同で行う。
2．L-FTZコア人工染色体を第二染色体として大腸菌細胞に導入して、この領域の必須遺伝子群を相補しながら、部位特異的な組換え酵素Clpを用いてL-FTZコア領域をゲノムDNAから欠失させる。この欠失変異細胞の作製は研究分担者の大島や末次と共同して行う。欠失変異細胞の作製が順調に進めば、この欠失細胞をヌクレオチド不足に曝して突然変異頻度を解析し、染色体の不安定化とL-FTZコア領域の関係を明らかにする。
|
| Causes of Carryover |
2021年度に、次世代シークエンサーや原子間力顕微鏡(AFM)を用いて、人工染色体のセルフリー複製産物を塩基レベル、および、DNA高次構造レベルで解析できなかった。そのために、2021年度の経費を繰り越して、この次世代シークエンサーとAFMを用いる実験のために、消耗品を購入する費用と、機器解析のための経費に使用する。
|
