2023 Fiscal Year Research-status Report
Roles and their molecular mechanisms of replication barrier zones programmed on chromosome for genome stability maintenance
| Project/Area Number |
21K06120
|
|---|
| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
|---|
Principal Investigator |
秋山 昌広 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 准教授 (80273837)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
末次 正幸 立教大学, 理学部, 教授 (00363341)
日詰 光治 埼玉医科大学, 医学部, 講師 (10378846)
大島 拓 富山県立大学, 工学部, 教授 (50346318)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
|
| Keywords | 複製阻害 / 複製ストレス / ヌクレオチド欠乏 / チミン飢餓死 / ゲノム不安定性 / 染色体構造タンパク質 / DNAポリメラーゼ / 複製フォーク |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
複製フォークでは、DNAポリメラーゼがチミンを含む4種類の基質を重合してゲノムDNAを合成する。チミンの欠乏状態では、この酵素反応の基質が一つ不足するために、複製フォークの進行が阻害される。さらに、細胞が迅速に、かつ、急激に生存力を失う「チミン飢餓死」を生じる。チミン飢餓死は今から60年以上前に発見され、この現象を起こす薬剤が医療現場で長年広く使用されている。しかし、微生物でも真核生物でも、細胞内の複製フォークの動態がゲノム全体で明らかでないために、未だにチミン飢餓死のメカニズムは謎のままである。
研究代表者は、チミン不足の大腸菌細胞の複製フォークは、複製開始点oriCの両側近傍に位置する約200kbのゲノム領域（複製遅延領域FTZ: Fork Trapping Zone）で高頻度に阻害されることを見出した。さらに、これらの二つのFTZで囲まれたoriC周辺領域は、チミン飢餓死で消失するゲノムDNA領域と一致した。そこで、本研究では、「チミン不足時に、選択的にFTZで複製フォークの進行を阻害する仕組みと、その役割は何か」を明らかにして、チミン飢餓での複製阻害とゲノム不安定化のメカニズムの解明を目指す。
これまでに、oriC左側のFTZ領域(L-FTZ)のコア領域を含むFTZ人工染色体を構築し、大腸菌の複製タンパク質を用いてセルフリー複製して解析した。また、細胞内の複製フォークの動態を、ブロモ・デオキシウリジンの取り込みによって間接的に解析するのではなく、複製フォークで働くDNAポリメラーゼのゲノム分布から直接解析した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
これまでに、L-FTZのコア領域（約50 kb）を持つFTZ人工染色体を構築し、試験管内でセルフリー複製した。また、原子間力顕微鏡(AFM)を用いてこのDNA複製産物を観察して、人工染色体DNAを検出できた。しかし、染色体構造タンパク質H-NSの添加やヌクレオチド枯渇の条件で複製したDNA産物を、AFMや次世代シークエンサーで解析した結果、複製フォークの停止を検出できなかった。また、L-FTZのコア領域の遺伝子群を相補して、この領域をゲノムから欠失させるために、DNA複製能とDNA分配能を強化したFTZ人工染色体を大腸菌細胞に導入した。しかし、ゲノムの一部を欠失させられるほどに十分安定に、この人工染色体を維持できなかった。そのため、当初の計画を達成できなかった。
これまでは、複製フォークのDNAポリメラーゼが重合するチミン類似体（ブロモ・デオキシウリジン）のゲノム分布を解析することによって、細胞内の複製フォーク動態を間接的に解析してきた。本研究では、DNAポリメラーゼの分布をゲノム全体のレベルで初めて決定して、細胞内の複製フォーク動態を直接的に解析した。これらの状況から、計画の進捗は遅れていると判断した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
研究計画を一部変更して、チミン不足に依存した複製フォーク進行の変化を、DNAポリメラーゼのゲノム分布によって解析する。また、複製開始点oriCの周辺領域における、DNAポリメラーゼの蓄積に影響する遺伝子を明らかにする。これらの解析から、DNAポリメラーゼの蓄積とFTZの関係を明らかにする。これらの解析は、研究分担者と共同で行う。
|
| Causes of Carryover |
研究計画を一部変更したので2024年度に経費を繰り越して、DNAポリメラーゼの分布を解析するための次世代シークエンサの費用、および、それに必要な消耗品を購入する費用に使用する。また、論文の英文校閲と、国際科学雑誌への投稿にも経費を使用する。
|
