2021 Fiscal Year Research-status Report
Development of muliplex, large-scale, and high-resolution genome editing technology using multi-class CRISPR system
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21K06137
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
佐久間 哲史 広島大学, 統合生命科学研究科(理), 准教授 (90711143)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / CRISPR-Cas / 遺伝子ノックイン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、異なるクラス・タイプのCRISPRシステムを組み合わせた新手法“マルチクラスCRISPR”によって、これまで実現困難であった多重・大規模かつ高精細なゲノム編集を可能にするシステムを確立することを目的としている。2021年度は、マルチクラスCRISPRに用いるための各クラス・タイプのCRISPRシステムにおける技術基盤の確立・改良を実施した。
クラス1システムにおいては、ゲノム編集を効率化・制御させるための因子集積のシステム開発を実施した。各種RNAアプタマーを付与したcrRNAのscaffoldを揃えつつ、それに結合するタンパク質を融合させた任意の因子を標的ゲノム領域に集積させるプラットフォームを構築し、機能性を実証した。更に、クラス2システムを用いて実証されてきた、タンパク質タグの利用によるより高度な集積についてもクラス1システムで動作し得ることを確認した。
クラス2システムにおいては、MMEJを利用した独自の遺伝子ノックイン技術であるPITCh法を、異なるタイプのシステムにも拡張するため、Cas12aを用いたPITCh法の技術基盤の確立を進めた。Cas12aでは、突出末端で切断されることやPAMの位置が異なることなどから、Cas9と同一の設計でノックインを実施することはできず、ノックイン設計の最適化が必要であったが、適切な設計を見出すことに成功し、PCRレベルおよび配列レベルで正確なノックインが実行できたことが確認された。更に、Cas9を用いたPITCh法によるノックインについても、効率化技術として2018年に確立したLoAD法の効果を更に上回るノックイン効率上昇システムの開発に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
「研究実績の概要」欄に記載したように、最終目標であるマルチクラスCRISPRシステムのために必要となる各要素技術の開発・改良を進め、クラス1 CRISPRについてはシステムの高度化に必要なツールキットが整備できた。クラス2 CRISPRについては、タイプVに属するCas12aを用いたノックイン技術の基盤を確立すると共に、タイプIIに属するCas9を用いたノックインの更なる高度化を実現した。これらの要素技術は、マルチクラスCRISPRを確立するために必要不可欠であり、初年度の成果として十分な進展があったと判断できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、クラス1・クラス2の各要素技術を更に改良・進化させることで技術レベルの底上げを図ると共に、これらを組み合わせることで、ベクターのランダム挿入等の目的外産物を極限まで排し、多数の遺伝子座を同時に、高効率かつ確実に改変できるようなシステムの開発を目指す。また不要なゲノム配列の除去や複数の外来DNAドナーのドッキングなどの高度な操作を、シームレスかつ一塩基レベルで精密に規定した連結部を伴って実行するなど、精密さと広汎さを併せ持ち、かつ多重性、安全性、確実性に長けるこれまでにないゲノム編集法を確立することを試みる。
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| Causes of Carryover |
コロナ禍により学会がオンライン化されたため、旅費が不要になったことから、次年度使用額が生じた。2022年度には、多くの学会が現地開催となることから、当初の計画通り旅費として使用する予定である。
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[Journal Article] Genome editing with removable TALEN vectors harboring a yeast centromere and autonomous replication sequence in oleaginous microalga2022
Author(s)
Tomokazu Kurita, Masako Iwai, Keishi Moroi, Kumiko Okazaki, Seiji Nomura, Fumihiko Saito, Shinichiro Maeda, Akihide Takami, Atsushi Sakamoto, Hiroyuki Ohta, Tetsushi Sakuma, Takashi Yamamoto
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Journal Title
Scientific Reports
Volume: 12
Pages: 2480
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Panel of human cell lines with human/mouse artificial chromosomes2022
Author(s)
Narumi Uno, Shuta Takata, Shinya Komoto, Hitomaru Miyamoto, Yuji Nakayama, Mitsuhiko Osaki, Ryota Mayuzumi, Natsumi Miyazaki, Chiaki Hando, Satoshi Abe, Tetsushi Sakuma, Takashi Yamamoto, Teruhiko Suzuki, Yoshihiro Nakajima, Mitsuo Oshimura, Kazuma Tomizuka, Yasuhiro Kazuki
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Journal Title
Scientific Reports
Volume: 12
Pages: 3009
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] TALEN-Mediated Gene Editing of slc24a5 (Solute Carrier Family 24, Member 5) in Kawakawa, Euthynnus affinis2021
Author(s)
Dipak Pandey, Takahiro Matsubara, Taiju Saito, Yukinori Kazeto, Koichiro Gen, Tetsushi Sakuma, Takashi Yamamoto, Miyuki Mekuchi, Rie Goto
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Journal Title
Journal of Marine Science and Engineering
Volume: 9
Pages: 1378
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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