2022 Fiscal Year Research-status Report
Development of muliplex, large-scale, and high-resolution genome editing technology using multi-class CRISPR system
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21K06137
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
佐久間 哲史 広島大学, 統合生命科学研究科(理), 准教授 (90711143)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / CRISPR-Cas / 遺伝子ノックイン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2022年度は、前年度に引き続き、マルチクラスCRISPRに用いるための各クラス・タイプのCRISPRシステムにおける技術基盤の更なる改良を進めた。
クラス1システムにおいては、CRISPR-Cas3を用いた遺伝子ノックインの最適化を実施した。まず、ドナーベクターの構造として、ホモロジー配列の両外側にCRISPR-Cas3の標的配列を配し、挿入する遺伝子カセットがプラスミドベクターから切り出されるように設計することで、ノックインの効率が高まることを示した。また、Cas3とCascadeが単一のベクターから発現するように改良を加えたall-in-oneベクターの機能性を実証した。更に、様々なホモロジーアーム長でのノックインの検証を実施することで、効率的なノックインに必要となるホモロジー配列長を同定することに成功した。興味深いことに、必要なホモロジー配列長には、ゲノム上の標的配列のPAM側と逆側で差異が存在した。
クラス2システムにおいては、過去に当グループが開発したゲノム編集の効率化技術であるLoADシステムを拡張し、従来使用していたMS2以外のRNAアプタマーおよびMS2コートタンパク質以外のRNA結合タンパク質のラインナップを整備した。これらを取り入れた拡張型LoADシステムの効果を検証したところ、使用するRNAアプタマーやRNA結合タンパク質によって編集結果に違いが生じることが明らかとなった。更に、先行研究においてゲノム編集パターンを変化させることが知られているT5exo-Cas9と拡張型LoAD法を組み合わせた検証を実施した結果、編集パターンの更なる変化が生じることも示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
「研究実績の概要」欄に記載した通り、クラス1 CRISPRによる遺伝子ノックインの最適化やクラス2 CRISPRを効率化させる拡張型LoADシステムの開発を通じて、初年度の成果を更に発展させることができた。これらの成果は、2023年6月に開催予定の日本ゲノム編集学会第8回大会でのポスター発表にそれぞれ採択されている。また、各成果は後述する最終年度の実施内容に繋がる成果であり、当年度の成果として十分な進展があったと判断できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度は、当年度までに開発したクラス1およびクラス2 CRISPRシステムの技術改良について論文化すると共に、これらの改良技術を基盤としたマルチクラスCRISPRシステムの有効性を実証する計画である。具体的には、前年度の報告書における今後の研究の推進方策にも記載した通り、ベクターのランダム挿入等の目的外産物を極限まで排し、多数の遺伝子座を同時に、高効率かつ確実に改変できるようなシステムの開発を目指す。また不要なゲノム配列の除去や複数の外来DNAドナーのドッキングなどの高度な操作を、シームレスかつ一塩基レベルで精密に規定した連結部を伴って実行するなど、精密さと広汎さを併せ持ち、かつ多重性、安全性、確実性に長けるこれまでにないゲノム編集法を確立することを試みる。
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