2022 Fiscal Year Research-status Report

難培養真菌のミニメタゲノム解析法の確立と新規遺伝子の探索

Research Project

Project/Area Number	21K06141
Research Institution	Institute of Physical and Chemical Research
Principal Investigator	梅山大地国立研究開発法人理化学研究所, 生命医科学研究センター, 研究員 (30706370)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	真菌の分離 / メタゲノム解析 / 蛍光ラベル / 磁気分離 / 溶菌酵素
Outline of Annual Research Achievements	昨年度まで真菌の細胞表面に存在するグルカンなどに特異的に結合するプローブを作製してきたが、今年度はそれらの結合能の向上を目指して実験を行った。結合ドメインと蛍光蛋白質を連結するリンカー長の最適化とドメインの多重化を行い、出芽酵母や分裂酵母をモデルに用いて結合能を評価した。ドメインをダイマー化したところ、全てのプローブで結合能の上昇がみられ、トリマー化したところ一部のプローブでわずかに結合能が増大した。しかし、ドメインの連結数を増やすにつれて発現量が低下し、テトラマー化、ペンタマー化しても結合能の上昇は見られなかった。そのため、プローブはダイマーあるいはトリマーとして用いることとした。また、N末端に分子シャペロンを融合したところ、結合能や発現量が上昇したプローブもあったため、それらはシャペロン融合たんぱく質として用いることとした。これらのプローブの発現量の上昇を目的として、開始コドン下流と終止コドン上流にTranslation Enhancer Elementを挿入したところ、全てのプローブで発現量の増大がみられた。また、ヒト糞便50 mgに対するプローブや磁性ビーズの投入量の最適化も行った。前年度までに見出した細菌特異的な溶菌酵素群の反応最適化を行った。文献検索を行ったところ、Zn2＋を補因子とする酵素も含まれていたため、反応系に添加するZnCl2濃度の最適化を行った。ヒト便に含まれる細菌量を16S rDNAのqPCRで定量したところ、ZnCl2を加えることで４倍程度活性が増大する条件を見出した。また、分子シャペロンの融合や反応時間および緩衝液の組成などの検討を行うことで細菌特異的な溶菌反応の最適化を行った。前年度までに最適化した密度勾配遠心の条件と今年度最適化したプローブとの結合条件や細菌特異的な溶菌反応条件を組み合わせて、実サンプルからの真菌の濃縮を開始した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ドメインをモノマーとして用いた初期型のプローブでは、出芽酵母や分裂酵母へ結合させた後の洗浄工程で乖離が見られていたが、結合ドメインをタンデムに連結することで結合能の上昇がみられ、これらの改良型のプローブではほぼ洗浄工程での乖離がみられなくなった。しかし連結数を増やすと発現量の低下がみられたため、研究を効率的に進める上で発現量を改善することが必要となった。そこで開始コドン下流の4残基と終止コドン上流の2残基に既に報告されていた翻訳促進配列を挿入してみたところ、全てのプローブで発現レベルの増大がみられ、結合能の低下はみられなかった。これらの実験結果から、十分な量の改良型プローブが調製できるようになったと判断してプローブ配列の最適化は終了して、多色ラベル化を行うために蛍光蛋白質の変更、ヒト便とプローブの量比の検討、あるいは投入するビーズ量の検討などの当初予定通していたプロトコールの最適化を進めることできた。
Strategy for Future Research Activity	ヒト便を用いて真菌を濃縮するプロトコール全体の最適化に取り組む。16SとITSの存在量をqPCRで定量することにより真菌の収量と純度を追跡し、十分に真菌が濃縮されていることが確認できたサンプルについては、ショットガンシーケンスを行って真菌叢のミニメタゲノム情報を得る。真菌の純度が十分でない場合は、密度勾配遠心やFACSで細胞を分取する条件を変更し、収量よりも純度を優先して決定する。プロトコール全体を最適化した後は、土壌、河川や海水などの実サンプルに含まれる真菌叢のミニメタゲノム解析を行う。また、真菌ゲノムのシングルセル解析を行うために、多様な真菌に適用可能なスフェロプラスト化法の検討に着手する。