難培養真菌のミニメタゲノム解析法の確立と新規遺伝子の探索

2023 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21K06141
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 梅山 大地 九州大学, 医学研究院, 特任助教 (30706370)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: ミニメタゲノム / 磁気分離 / 真菌叢 / 微生物叢 / 細菌叢 / タンパク質エンジニアリング

Outline of Annual Research Achievements

真菌細胞表面に存在する糖鎖をマーカーとして真菌細胞種を識別することを目指し、糖鎖の分岐パターン(β-1,4およびβ-1,6)によって結合能が異なる2種類のβ-グルカン結合ドメインを用いてそれぞれ蛍光プローブを作製した。ドメインの連結数やドメイン間のリンカー配列の検討を行い、出芽酵母に対する結合能を指標にして評価することで、親和性が向上した蛍光プローブを作製した。同様にαグルカンについても蛍光プローブを作製し、翻訳促進配列を挿入することで発現量を向上させた。また、主に細菌と真菌から構成される微生物叢においては、細菌の細胞数が非常に多いため、予め細菌と真菌を細胞の大きさを指標にして大まかに分離することが望ましい。そこで、密度勾配遠心で用いる担体の検討を行い、qPCRによる細菌の存在量を16S rDNA領域を用いて定量し、真菌の存在量をITS領域を用いて定量し、各フラクションに含まれる細菌と真菌の存在量を追跡し、真菌を50倍程度濃縮可能な条件を見出すことができた。
本年度は実サンプルからのミニメタゲノム解析を行うことを目指し、サンプル量と必要なプローブ量の検討と必要なプローブの調整を行った。また、昨年度までに検討を進めてきた①密度勾配遠心法、②細菌特異的な酵素分解法、③真菌特異的な蛍光プローブを用いた真菌の磁気分離法の各手法を組み合わせたプロトコールを用いて、動物の共生微生物叢や環境微生物叢からの真菌叢の濃縮とゲノム抽出を行った。