2021 Fiscal Year Research-status Report

Regulation of peroxisomal protein import and anti-oxidative stress response

Research Project

Project/Area Number	21K06155
Research Institution	Kyushu University
Principal Investigator	奥本寛治九州大学, 理学研究院, 助教 (20363319)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	ペルオキシソーム / リン酸化 / タンパク質輸送 / 酸化ストレス / カタラーゼ
Outline of Annual Research Achievements	原核生物から広く存在するカタラーゼは過酸化水素を無毒化する抗酸化酵素であり、哺乳類ではおもに細胞内小器官ペルオキシソームの内部に局在している。カタラーゼの輸送はPex14を中心とするペルオキシソーム膜上のタンパク質膜透過装置が担っている。私達はこれまでに、過酸化水素負荷時にPex14がリン酸化修飾され、これがカタラーゼのペルオキシソームへの輸送を選択的に抑制し、サイトゾル局在性カタラーゼ量の増加を介して細胞の酸化ストレス抵抗性を高める、という新たな抗ストレス応答機構を明らかにした。本申請課題では、Pex14のリン酸化に至る過酸化水素シグナル伝達経路の同定と、酸化ストレスに応答したペルオキシソームタンパク質の輸送の制御機構解明を目的として、カタラーゼの細胞内局在制御による新たな酸化ストレス応答機構の分子機構を解明する。本年度はPex14を直接リン酸化するキナーゼ（Pex14キナーゼと仮称）の同定を進めた。過酸化水素依存的なPex14のリン酸化誘導に対する各種キナーゼ阻害剤の影響を検討するなどして、酸化ストレスにより活性化されることが知られているMAPキナーゼ群の中でPex14のリン酸化に関与するキナーゼ候補を見出した。また、Pex14のC末に高活性型改良ビオチンリガーゼTurboIDを付加した融合タンパク質を作製し、これを用いた近接依存性標識法を構築した。酸化ストレス依存的にPex14と相互作用するタンパク質群を質量分析計により網羅的に同定し、その中からPex14のリン酸化誘導に関与するキナーゼの検索・解析を進める。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 過酸化水素処理時におけるPex14のリン酸化誘導を抑制する活性を持つキナーゼ阻害剤を見出し、これを端緒としてPex14のリン酸化に関与するキナーゼ候補を明らかにした。一方、別のアプローチとしてTurboIDを用いた近接依存性標識法をPex14キナーゼの同定に導入した。Pex14-TurboID融合タンパク質の作製、これを安定発現した動物培養細胞株の樹立、およびビオチン標識の条件検討などを実施し、酸化ストレス依存的にPex14と相互作用するタンパク質群を質量分析計により網羅的に同定する実験系を構築した。これらの成果から、ほぼ順調に進展していると判断した。
Strategy for Future Research Activity	本年度に見出したPex14のリン酸化に関わるPex14キナーゼ候補に関して、siRNAによるノックダウンや変異体を用いた強制的活性化などの解析を行う。当該分子がPex14キナーゼであることを検証するとともに、Pex14リン酸化の分子機構を明らかにする。また、TurboIDを用いた近接依存性標識法による解析も進めることで、酸化ストレス依存的にPex14と相互作用するタンパク質群を網羅的に同定する。これらの結果を統合的に解析し、酸化ストレスの感知からPex14のリン酸化に至る上流シグナル伝達経路を明らかにする。さらに、細胞の酸化ストレス応答におけるカタラーゼ、およびペルオキシソームの役割とその制御メカニズムの理解につなげる。
Causes of Carryover	コロナウイルス流行により学会参加および研究打ち合わせを見合わせ、あるいはオンラインで代替したことで旅費の計上がなくなった。次年度は実験計画を推進するとともに、実地での学会参加および論文投稿費を計上して使用計画に準じて予算を執行する。