エンドサイトーシスを引き起こす内在性分子群の多色超解像マップの作成

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K06168
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 木内 泰 京都大学, 医学研究科, 准教授 (70443984)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 超解像イメージング / エンドサイトーシス

Outline of Annual Research Achievements

膜受容体がエンドサイトーシスされる部位では、多種類の分子が時空間的に秩序だって配置し、受容体を取り込むための多分子構造が形成される。これまで様々な顕微鏡法によって、エンドサイトーシス部位で１～２種類の標的分子の空間分布や動態を可視化し、多数の部位の結果を平均化することでこの多分子構造が研究されてきた。しかし、各部位には可視化できていない多種類の内在性分子が局在している。特定の分子群が局在することで、次のステップに必要な分子が適切に配置され、その連続的な構造変化によって、エンドサイトーシスが引き起こされると考えられている。本研究では、同一の細胞で多種類のタンパク質を連続多重染色でき、高密度染色による精緻な画質を実現した超解像顕微鏡法IRIS（Kiuchi et al., Nat. Methods, 2015）を用いて、膜受容体のエンドサイトーシスに関わる内在性分子群の詳細なマップを作成する。内在性の標的分子に対するIRIS超解像プローブを作製するために抗血清からのポリクローナル抗体の精製方法や蛍光標識方法を詳細に検討している。その結果、エンドサイトーシス部位に局在する複数種類の内在性タンパク質の可視化に成功し、その特徴的な分布を捉えられた。現在、抗体由来のIRISプローブの種類を増やし、膜受容体のエンドサイトーシスを引き起こす多分子構造の全体像の解明を進めている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

IRIS超解像顕微鏡法では、標的に結合解離するプローブを用いて、標的を可視化する。これまでは、標的に結合するタンパク質のフラグメントから結合解離プローブを作製し、アクチン細胞骨格や微小管、中間径フィラメント、接着斑の超解像可視化を行ってきた。本研究では、アフィニティーカラムを用いて抗血清からポリクローナル抗体を精製し、蛍光標識する。カラムへの抗体の結合条件や抽出条件、蛍光色素の標識条件を検討することで、標的に結合解離する抗体由来プローブを作製する。まずClathrin light chain（CLC）とEps15に対する抗血清から抗体由来の結合解離プローブの作製方法を詳細に検討し、内在性のCLCとEps15の超解像可視化に成功した。現在、このプローブ作製方法でエンドサイトーシス部位に局在する６種類の内在性タンパク質に対する抗体由来プローブの作製を進めている。

Strategy for Future Research Activity

エンドサイトーシス部位に局在する内在性タンパク質群の超解像可視化プローブの作製した後は、EGF受容体のエンドサイトーシス時の各標的分子の位置関係を詳細に調べる。Transferrin受容体と異なり、EGF受容体のエンドサイトーシスには、Grb2が必須である。Grb2は、２つのSH3ドメインと１つのSH2ドメインを持つアダプタータンパク質である。Grb2は、とSH2ドメインを介して、リン酸化されたEGF受容体と結合し、さらにSH3ドメインを介して、エンドサイトーシスに関わる様々な分子（Eps15, Dyn2, Cblなど）と結合する。これらの分子の詳細な分布を可視化することで、Transferrin受容体とEGF受容体のエンドサイトーシスの分子メカニズムの違いを明らかにする。

Causes of Carryover

次年度使用額は、今年度の研究を効率的に推進したことに伴い発生した未使用額であり、2021年度請求額とあわせ、2022年度の研究遂行に使用する予定である。