2022 Fiscal Year Research-status Report
細胞接着制御因子Rap1による新たな好中球細胞死制御メカニズムの解明
| Project/Area Number |
21K06181
|
|---|
| Research Institution | Kansai Medical University |
|---|
Principal Investigator |
上岡 裕治 関西医科大学, 医学部, 講師 (50511424)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
|
| Keywords | integrin / Rap1 / NETosis |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
細胞接着シグナルとNETosisとの関連性を示唆する報告はあるものの、NETosisの詳細な分子メカニズムは未だ不明である。また、定量的なNETosisの評価が難しい現状がある。
本研究課題では、当該年度において細胞接着を制御するRap1シグナル分子の好中球特異的ノックアウトマウスの作出を完了し、予定していたノックアウトマウスのバリエーションを揃えることができた。しかし、コロナ禍でのケージ数削減などもあり同時での複数種の比較実験ができていない。いったん数を減らさざるをえなかかったノックアウトマウスの数を再びそろえて比較実験を行う予定である。
各種ノックアウトマウスの骨髄由来の好中球を精製してin vitro解析を進めたが、好中球特異的Talin1ノックアウトマウスの骨髄由来細胞ではTalin1のノックアウトが不十分であったため、細胞調整の段階で再検討を要した。骨髄内の未分化好中球ではCreによる遺伝子発現阻害が不十分だと考え、末梢（腹腔）からの好中球回収を進めた。LPS、Zymosan、caseinの腹腔内投与で惹起される好中球浸潤を野生型と好中球特異的Mst1ノックアウトマウスを用いて腹腔内および血中で比較した。新しい回収法によりin vitroの実験に使える細胞数を確保することは可能であるが、必要なマウス数を減らすためには今後は刺激後の経時的なデータを集める必要がある。
NETosisの定量的画像評価に関しては再現性や解析方法に課題はあるものの、類似の報告が近年多く報告されており、静止画での解析は学術的新規性が薄れていると判断した。そのため、血管内の血流を模倣した条件下での解析を進めている。最終年度で動画データを用いた機械学習を導入し、MATLABソフトウエアでNETosis形態評価プログラムを進める予定である。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
コロナ禍でマウス飼育頭数の制限などがあったが、好中球特異的Mst1ノックアウトマウス作出を完了した。LPS投与による肺での好中球浸潤を組織化学的染色および気管支肺胞内洗浄で評価する実験系では、ある程度まとまったマウス数が必要だったが、必要なマウス数を用意できなかったため最終年度に再度実施する予定である。気管支肺胞内洗浄で評価する代わりに、LPS等の腹腔内投与による好中球浸潤を野生型と好中球特異的Mst1ノックアウトマウスで評価した。好中球特異的Talin1ノックアウトマウス（LysM-Cre, Talin1 flox/flox）の骨髄由来細胞ではTalin1のノックアウトが不十分であったため、細胞回収の条件を再検討している。NETosisの定量的画像評価に関しては再現性や解析方法に課題はあるものの、類似の報告が近年多く報告されており、静止画での解析は学術的新規性が薄れていると判断した。そのため、血管内の血流を模倣した条件下での解析を進めている。最終年度で動画データを用いた機械学習を導入し、MATLABソフトウエアでNETosis形態評価プログラムを進める予定である。
|
| Strategy for Future Research Activity |
概ね当初の計画通りで進める予定である。類似の研究報告が増えており予定していた実験内容では学術的新規性が薄れたため、方針を一部変更し、生体に近い環境下（疑似血流のある条件下）での観察系を立ち上げ、解析を進めている。最終年度でNETosisプロセスの動画データに関する定量評価を行う予定である。また、大学内の他講座との共同研究の可能性も出てきたため、ある程度打ち合わせを行い、本研究課題を進める方向であれば積極的に共同研究を進めようと考えている。Rap1シグナルの好中球特異的ノックアウトマウスを用いて好中球の接着能、エネルギー代謝、ROS産生能（ミトコンドリア機能、動態）を野生型で比較し、Rap1シグナルとNETosis制御メカニズムとの関係を明らかにする予定である。
|
