2022 Fiscal Year Research-status Report
Studies on the pleiotropic functions and transcriptional regulation of gbx homeobox genes in the development of the vertebrate brain.
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21K06182
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| Research Institution | Saitama University |
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Principal Investigator |
弥益 恭 埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (60230439)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
津田 佐知子 埼玉大学, 理工学研究科, 准教授 (80736786)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 脳発生 / 中脳後脳境界 / 峡部 / gbxホメオボックス遺伝子 / 発生遺伝学 / 転写制御機構 / 変異体作製 / 発生運命追跡 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
脊椎動物の発生において中脳後脳境界（MHB）は中脳、小脳のパターン形成を制御するシグナル分泌センターである。本研究では、MHB形成に関わるgbx遺伝子の機能と発現制御機構について、ゼブラフィッシュを用いて発生遺伝学研究を進めている。
令和4年度はまず、gbxの峡部発生における機能の再評価のため、CRISPR/Cas9法により各gbx（gbx1、gbx2）の完全欠失変異体の作製を進め、これまでgbx1全欠失変異体の系統化を行った（gbx1dFD）。この変異体では原腸形成後期において、gbx1の発現は予想通りに消失するが、gbx2の発現には異常が認められず、gbx1の欠損下でもMHBは決定されること、gbx1はこの時期のgbx2発現に必要ないことが確認された。
一方、gbxの転写制御機構にも取り組んでおり、gbx1については上流遺伝子（asb10）までの全上流領域（5.5 kb）の欠失変異体の系統化を完了した。この変異体において、後期原腸胚における後方神経板でのgbx1発現は正常であるが、体節形成終了期での後脳発現が消失した。つまり、上流5.5 kb内に後脳エンハンサーがあると推定された。転写調節能の上流内の分布については、egfp/luciferaseレポーターを用いた胚での転写調節能解析で明らかにした。また、この上流欠失変異体では後脳における神経分化の異常を観察しており、gbx1が後脳での神経分化に必要であることを示した。下流欠失変異体作製はまだ進行中であるが、並行して行った脊椎動物種間の大規模ゲノム配列比較の結果、下流2カ所に哺乳類以外の脊椎動物で保存された配列を見出し（DCS1/DCS2）、これらが原腸胚で転写活性化能を持つことも確認した。gbx2については、上流全域（130 kb）と下流全域（8 kb）の欠失変異体作製を引きつづき進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、まず遺伝子全欠失変異体を作製した上で表現型解析を行うことをめざしたが、これまでにgbx1の全遺伝子欠失と系統化に成功した。この変異体での表現型解析も開始しており、予想通りにgbx1自体の発現は消失すること、gbx2の発現が原腸胚期ではほぼ正常であり、MHBは決定されていることも確認した。遺伝子全域欠失であることから転写適応を回避している。さらに gbx2の発現が少なくとも原腸胚後期では正常であることから、gbx2の発現亢進による機能補償の可能性も低い。今後、gbx2の完全欠失も完成させ、将来的には2重変異体で脳形成に関する表現型解析を行い、gbx遺伝子の機能にさらに詳細に迫れる基盤ができたと言える。
gbxの転写制御機構の解析については、すでにCRISPR/Cas9法によるgbx1の全上流ゲノムDNA欠失変異体の作製と表現型解析により、上流5.5 kb領域内に後脳エンハンサーがあることを示していたが、さらにこの変異体では後脳での神経発生が欠損することよりgbx1の後脳での神経発生における重要性を明らかにした。gbx1が後脳領域で発現することはマウスとゼブラフィッシュで知られていたが、その機能についてはいずれの種でも知られておらず、大きな成果と言える。なお、上流欠失変異体はNBRP（ゼブラフィッシュ）への寄託も行っている。gbx1の下流ゲノム領域については種間保存配列の探索と胚を用いたin vivoレポーター解析により原腸胚でのgbx1発現エンハンサー候補を見出しており、全く未知だったgbx1の発現制御に迫る足がかりが得られたと考える。
gbx2についても全上流欠失変異体と全下流欠失変異体の作製によるエンハンサーの網羅的同定をめざしており、まだ系統化には至っていないが、欠失導入自体には成功しており、現在さらに系統化が進行中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
gbx1全欠失変異体については様々な発生段階のゼブラフィッシュ胚において、MHB周辺脳原基の領域化に焦点を当てて形態的、組織的、そして遺伝子レベルで検討する。また、神経発生への関与にも注目する。gbx2についても転写適応を避けるため、CRISPR/Cas9法により遺伝子全欠失変異体の作製と系統化を行う。両gbx遺伝子欠失変異体がそろった段階で各遺伝子の単独変異体、そして2重変異体において、MHBの決定、脳領域化、神経発生に関して表現型解析を行う。以上により、現在混乱した状況にあるgbx遺伝子の脳形成における役割を精査する予定である。
gbx1の転写制御については、後脳エンハンサー機能を持つ上流5.5 kb領域にさらに部分的欠失を導入してgbx1の内在発現への影響を検討する。これにより調節能を確認した小領域の転写制御活性について、胚及び培養細胞でのレポーター解析により詳細かつ定量的な検討を行い、エンハンサー主要部を特定する。また、VISTA解析などで見出されている保存配列を検討することによってもエンハンサーコア配列の推定を行う。同定された配列内に結合する転写因子を予測した上、エンハンサーへの結合能や実際の転写制御能を、EMSA法やChIP法により検討する。gbx1下流欠失変異体の系統化も進め、下流領域の転写制御能を検討する。特に、令和4年度に同定した原腸胚での神経板エンハンサー候補についても欠失導入での機能解析、レポーター解析、そして結合タンパク質の同定を通して作用機構を明らかにする。gbx2については、3つのMHBエンハンサーについての多重欠失変異体を作製してgbx2発現への影響を調べ、シャドウエンハンサーの役割を検討するとともに、全上流欠失、全下流欠失変異他の作製と系統化をさらに進め、そのgbx2などの発現への影響を検討し、gbx2の転写制御の全容の理解をめざす。
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| Causes of Carryover |
当該次年度使用額が生じた理由は主として、令和４年度において参加した学会（日本発生生物学会、金沢；日本動物学会、東京；日本分子生物学会、幕張）が比較的近郊地域での開催であり（金沢を除く）、旅費、宿泊費が想定より少なかったことが大きい。生じた使用額は令和5年度では物品費に当てる予定である。
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