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2023 Fiscal Year Research-status Report

Studies on the pleiotropic functions and transcriptional regulation of gbx homeobox genes in the development of the vertebrate brain.

Research Project

Project/Area Number 21K06182
Research InstitutionSaitama University

Principal Investigator

弥益 恭  埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (60230439)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 津田 佐知子  埼玉大学, 理工学研究科, 准教授 (80736786)
Project Period (FY) 2021-04-01 – 2025-03-31
Keywords脳発生 / 中脳後脳境界 / 峡部 / gbxホメオボックス遺伝子 / 発生遺伝学 / 転写制御機構 / 変異体作製
Outline of Annual Research Achievements

・脊椎動物の発生において、中脳後脳境界(MHB)は中脳および小脳のパターン形成を制御する重要なシグナル分泌センターである。本研究では、MHB形成に関わるgbx遺伝子の機能と発現制御機構について、ゼブラフィッシュを用いて発生遺伝学研究を進めている。
・令和5年度は、以前にCRISPR/Cas9法により作製したgbx1全遺伝子欠失変異(gbx1dFD)の胚において、峡部の形態とMHBマーカーの発現を検討した。予想通りにgbx1の発現は完全に消失していたが、ほかに明確な異常は見られておらず、現在さらに脳形成について表現型解析を進めている。
・gbx1から上流遺伝子(asb10)までの全上流領域(5.5 kb)を欠失させた変異体胚(gbx1dUS)では体節形成期後脳でのgbx1の発現が全域で消失すること、後脳での神経分化が異常となることをすでに観察している。そこで、体節形成期の後脳におけるgbx1の役割を知ることを目的として、gbx1dUS胚と野生型胚各々から全RNAを抽出し、これらを用いてgbx1dUS胚での発現変動をRNA-Seqで網羅的に検討し、多様な遺伝子について発現異常を見出した。現在これらの遺伝子発現異常について、WISHおよびqRT-PCRにより確認を進めている。
・種間の大規模ゲノム配列比較の結果、gbx1の下流2カ所に哺乳類以外の脊椎動物で保存された配列を見出し(DCS1/DCS2)、これらが原腸胚後方神経板で転写活性化能を持つことを、胚を用いたEGFPレポーター解析で確認した。これら各々の胚発生での役割を検討するため、CRISPR/Cas9法により欠失を行い、系統化を進めている。また、DCS1がgbx1下流のみならず、羊膜類gbx2の下流にも存在することを見いだしており、現在ニワトリ胚でのgbx1の発現解析に着手している。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

・これまで、gbx1全遺伝子欠失変異体についての表現型解析をMHBの決定と峡部形成に関連して進めてきており、その意味では順調である。ただしこれまでMHB・峡部では明らかな発生異常が見られておらず、異なる発生時期、異なる多様なマーカー遺伝子を用いた検討が必要である。gbx1はゼブラフィッシュとマウスで体節形成期の後脳各菱脳節で発現しており、この時期でのgbx1の役割について、神経発生などに注目したさらなる表現型の検討が必要であろう。
・体節形成期での後脳形成におけるgbx1の役割を知るため、野生型胚および全上流欠失変異体胚(gbx1dUS)でトランスクリプトーム解析を実施した。今後、得られた網羅的発現解析の結果を利用することで、これまで未知だった体節形成期でのgbx1の機能について、全容の解明に貢献できると期待される。
・gbx1の上流5.5 kb領域が体節形成期における後脳での発現に必要であることは判明しており、その内部での調節エレメントの特定を予定していたが、技術的問題によりやや遅れ気味といえる。今後、上流DNAをPCRで効率的に増幅し、得られた増幅DNAを用いて必要なレポーターコンストラクト(EGFP/Luciferaseレポーター)を作製し、胚レベル、培養細胞系でのレポーター解析を行う予定であり、その準備を進めた。
・gbx1の原腸形成期後方神経板での発現はMHBの決定に関わる点で重要であり、この発現制御に下流保存配列(DCS1/DCS2)に関わることがすでに胚におけるレポーター解析で示唆されたが、これらの保存配列がgbx1の内在発現に必要かについては不明である。今年度、これらの保存配列の胚ゲノムにおける欠失には成功しており、これら欠失変異体の系統化を完成させることで、各保存配列が実際にMHB決定に関わるかの確認が期待される。

Strategy for Future Research Activity

・gbx1全遺伝子欠失変異体については、引きつづき峡部発生への影響について、異なる発生時期、異なる多様なマーカー遺伝子を用いて表現型の検討を進める。また、gbx1変異体にgbx2変異を導入することでもgbx遺伝子の役割を検討する。さらに、2つのgbx遺伝子の中でgbx1のみで体節形成期後脳で発現することに注目し、この時期でのgbx1の役割について、神経発生遺伝子(プロニューラル遺伝子、神経分化遺伝子など)の発現などの表現型解析を進める。
・体節形成期での後脳形成におけるgbx1の役割を知るため、この時期の上流欠失変異体胚(gbx1dUS)での発現変動をトランスクリプトーム(RNA-Seq)解析で既に検討しており、今後、得られた解析結果を参考に体節形成期でのgbx1の機能に関わると予想される遺伝子群を特定し、各遺伝子について、qRT-PCRやWISHで変異体胚での実際の発現を確認する。また、これらの遺伝子の後脳発生での役割について、強制発現やノックダウンなどで検証を行う。
・gbx1の上流5.5 kb領域による体節形成期後脳での発現制御に関し、その内部での調節エレメントの特定を進める。すでに上流DNAのクローニングを進めており、これらのDNAを用いて必要なレポーターコンストラクトを作製した上、胚レベル、培養細胞系でレポーター解析を行うことを計画している。
・gbx1の原腸形成期後方神経板での発現に関わることが示唆された下流保存配列(DCS1/DCS2)の役割の検討を進める。具体的には、これらの保存配列の欠失変異体の系統化を完成させ、得られた変異体胚でのgbxの発現を検討することでMHB決定に関わるかを確認し、レポーター解析により後方神経板特異的転写制御領域の特定を行う。これにより、ゼブラフィッシュ胚でのMHB決定機構の検討をさらに進める。

Causes of Carryover

令和4年度において参加した学会がオンラインだったために出張費が不要となり、令和5年度当初の繰越額が239,047円に達していたところ、6年度では繰越額が129,712円となっており、実際には5年度で執行額はむしろ予定より増加している。その主たる理由は、RNA-Seq解析に費用がかかった点にある。結果的に5年度で生じた繰越分については令和6年度において物品費に当てる予定である。

  • Research Products

    (13 results)

All 2024 2023 Other

All Journal Article (4 results) (of which Int'l Joint Research: 3 results,  Peer Reviewed: 4 results,  Open Access: 3 results) Presentation (8 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] Elongation of the developing spinal cord is driven by Oct4‐type transcription factor‐mediated regulation of retinoic acid signaling in zebrafish embryos2024

    • Author(s)
      Yuikawa Tatsuya、Sato Takehisa、Ikeda Masaaki、Tsuruoka Momo、Yasuda Kaede、Sato Yuto、Nasu Kouhei、Yamasu Kyo
    • Journal Title

      Developmental Dynamics

      Volume: 253 Pages: 404~422

    • DOI

      10.1002/dvdy.666

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Involvement of <scp><i>nr2f</i></scp> genes in brain regionalization and eye development during early zebrafish development2024

    • Author(s)
      Chowdhury Gazlima、Umeda Koto、Ohyanagi Takero、Nasu Kouhei、Yamasu Kyo
    • Journal Title

      Development, Growth &amp; Differentiation

      Volume: 66 Pages: 145~160

    • DOI

      10.1111/dgd.12912

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Evolutionarily conserved roles of <i>foxg1a</i> in the developing subpallium of zebrafish embryos2024

    • Author(s)
      Umeda Koto、Tanaka Kaiho、Chowdhury Gazlima、Nasu Kouhei、Kuroyanagi Yuri、Yamasu Kyo
    • Journal Title

      Development, Growth &amp; Differentiation

      Volume: 66 Pages: 219~234

    • DOI

      10.1111/dgd.12917

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Endosulfan affects embryonic development synergistically under elevated ambient temperature2023

    • Author(s)
      Zaman Tanjeena、Fahad Talukdar Mohammad、Rana Masud、Hossain Md Shahadat、Mamun Al、Haque Md Anwarul、Sarker Ashananda、Islam Md Shariful、Haque Md Minhaz-U. L.、Naz Tarannum、Manik Md Imran Nur、Ali Hazrat、Yamasu Kyo、Khan Alam
    • Journal Title

      Environmental Science and Pollution Research

      Volume: 30 Pages: 73393~73404

    • DOI

      10.1007/s11356-023-27665-z

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Presentation] Genetic studies on the regulatory roles of Nr2f genes in zebrafish development2023

    • Author(s)
      Chowdhury Gazlima, Koto Umeda, Takuma Kamimura, Tatsuya Yuikawa, Momo Tsuruoka, Takero Ohyanagi, and Kyo Yamasu
    • Organizer
      29th Japanese Medaka and Zebrafish Meeting
  • [Presentation] Studies on the role of POUV genes and secreted signals during spinal cord elongation in vertebrate embryos2023

    • Author(s)
      Tatsuya Yuikawa, Kaede Yasuda, Momo Tsuruoka and Kyo Yamasu
    • Organizer
      29th Japanese Medaka and Zebrafish Meeting
  • [Presentation] Genetic analysis of the roles of soxB1 in spinal cord elongation in zebrafish embryos.2023

    • Author(s)
      Ayu Ishikura, Tatsuya Yuikawa, Yuto Sato, Kaede Yasuda, Keiko Nakao, and Kyo Yamasu
    • Organizer
      29th Japanese Medaka and Zebrafish Meeting
  • [Presentation] Hes/her gene-mediated regulation of the pattern of primary neurogenesis in developing neuroectoderm2023

    • Author(s)
      Momo Tsuruoka, Takero Oyanagi, Kaede Yasuda, Yuto Sato, and Kyo Yamasu
    • Organizer
      29th Japanese Medaka and Zebrafish Meeting
  • [Presentation] Studies on the roles of the gene network in dorsoventral patterning of the telencephalon in zebrafish embryos2023

    • Author(s)
      Takuma Kamimura, Koto Umeda, Kouhei Nasu, Masato Maekawa, Shiho Suzuki, Kyo Yamasu
    • Organizer
      29th Japanese Medaka and Zebrafish Meeting
  • [Presentation] Identification of the regulatory regions of gbx1 that positions the isthmus during gastrulation and regulates later expression in zebrafish embryos2023

    • Author(s)
      Ayako Yokokawa, Ayano Tobita, Ryusei Shimizu, and Kyo Yamasu
    • Organizer
      29th Japanese Medaka and Zebrafish Meeting
  • [Presentation] Genetics analysis of the role of dec genes in biological clock development in zebrafish2023

    • Author(s)
      Shogo Osaki, Mika Saito, Ryo Ikeda, Shogo Ono, Kyo Yamasu
    • Organizer
      29th Japanese Medaka and Zebrafish Meeting
  • [Presentation] 神経外胚葉における一次神経発生パターンのHes/her遺伝子を介した決定機構2023

    • Author(s)
      鶴岡もも、大柳毅郎、安田楓、佐藤優人、弥益 恭
    • Organizer
      第46回 日本分子生物学会年会
  • [Remarks] 埼玉大学大学院理工学研究科生命科学部門 理学部生体制御学科 発生生物学研究室

    • URL

      http://devbiol.seitai.saitama-u.ac.jp

URL: 

Published: 2024-12-25  

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