2021 Fiscal Year Research-status Report

ツメガエル胚の外胚葉パターニングにおける細胞張力依存的シグナル伝達制御機構

Research Project

Project/Area Number	21K06183
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	道上達男東京大学, 大学院総合文化研究科, 教授 (10282724)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	山元孝佳東京大学, 大学院総合文化研究科, 助教 (70724699)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	細胞張力 / 外胚葉パターニング / アフリカツメガエル / ヒトiPS細胞 / プラコード
Outline of Annual Research Achievements	神経板・神経堤・プラコード・表皮から構成される外胚葉領域の正しい規定は正確な胚発生を行う上で必須である。外胚葉領域の部域化にはシグナル経路が関与するが、細胞の位置関係が刻々と変化する中、リガンドの濃淡以外の仕組みも必要であると考えられる。近年、細胞内シグナルのON-OFFに物理的な力が関与する研究が報告されている。しかし、シグナル経路、細胞張力、そして外胚葉パターニングを直接結びつけた研究はまだまだ少ない。そこで本課題ではツメガエル胚・iPS細胞を用い、(1)外胚葉パターニングにおいて部位特異的な張力がどのようにシグナル経路に影響を与え、神経板をはじめとする外胚葉のパターン形成にどのように貢献するかについて調べるとともに、(2)伸展刺激によりBMPなどの細胞内シグナリングが変動する根拠は何か、その分子メカニズムを明らかにすることを目的としている。令和三年度の実績としては、①BMP阻害因子chordinを注入した予定神経外胚葉片を、非注入胚由来の外胚葉片とともにシリコンチャンバーによって伸展刺激を加え、外胚葉マーカー遺伝子の発現がどのように変化するか、またFRET張力プローブを用いて伸展刺激時の張力変化の違うかどうかについて調べている。現在までに、RT-qPCRの結果より、伸展刺激の有無で一部神経マーカー遺伝子の発現量に差が生じることを見出している。②細胞の頂端収縮をうながすplekhg5を胚に微量注入して人為的に細胞に張力を付与すると、外胚葉マーカー遺伝子の発現パターン・発現量が変動することを見出した。③ヒトiPS細胞から神経細胞に分化させる系における張力の関与については、これまでに分化中期における伸展刺激付与によりプラコード遺伝子、神経板遺伝子の発現変動が確認された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ①BMP阻害因子chordinを注入した予定神経外胚葉片を、非注入胚由来の外胚葉片とともにシリコンチャンバーによって伸展刺激を加え、外胚葉マーカー遺伝子の発現がどのように変化するかを調べた。まずRT-PCRの結果から、伸展刺激により神経板マーカー遺伝子であるSox2の発現の減少、さらには一部の神経堤マーカーの発現変動も観察された。また、抗体染色による発現パターンの変動を調べた。これまで空間的な発現パターンは事実上in situハイブリダイゼーションしか用いることが出来なかったが、R3年度では様々な抗体について利用可能かどうかを調べ、Sox3、six1、Pax3、AP2などの発現の可視化ができるようになった。現在はこれらを用いて伸展刺激によるパターン変動の有無を解析中である。また同時に、FRET張力プローブを注入した外胚葉片を用い、chordin注入の有無で伸展刺激時の張力変化が違うかどうかについて調べている。 ②細胞の頂端収縮をうながすplekhg5を胚の一部に微量注入し、外胚葉マーカー遺伝子の発現パターンの変化を調べた結果、plekhg5注入領域付近で発現する神経板・神経堤領域の拡大などが観察された。この領域拡大は細胞面積の拡大は伴わないことから、張力付与により細胞の予定運命の変化が生じたことを示唆する。 ③ヒトiPS細胞から神経細胞に分化させる系において、分化中期の細胞に伸展刺激を加えると、プラコード遺伝子であるsix1陽性細胞が増加するという結果を得た。このことは、両生類胚だけでなくヒト由来細胞においても、張力刺激が神経（あるいはその一部）予定運命決定になんらかの影響を与えうることを示唆するものである。
Strategy for Future Research Activity	①ひきつづき、chordin注入外胚葉片の伸展刺激付与によるマーカー遺伝子の発現変動を抗体染色、qPCRなどにより調べる。また、張力プローブによる張力実測を行い、神経外胚葉と表皮外胚葉（あるいはその境界領域）の細胞の物理的性状にどのような特徴があるか調べる。 ②Plekhg5による人為的な張力付与系に加え、逆に細胞頂端の弛緩をひきおこすような遺伝子の注入を試み、逆の結果が得られるかどうかを検証する。また、plekhg5そのものが胚パターニングに関与するかどうかについても、発現解析、あるいはMOなどによるノックダウンの効果を調べることで検証する。 ③iPS細胞・神経分化誘導系では、ツメガエル胚同様、伸展刺激時にBMPシグナルが亢進するかどうかをリン酸化Smad1抗体を用いたウエスタン解析・免疫染色により調べるとともに、伸展刺激の強さ、あるいは時期を変化させたとき、プラコード・神経堤・神経板のうちどのマーカー遺伝子が上昇するかを調べることにより、物理的な力の付与と分化指向性との関連づけをより詳細に解析していく。 ④当初計画のように、細胞張力付与によりBMPシグナルが変動する根拠となる分子メカニズムの解析に取り組みたい。具体的には、BMP受容体に結合するLIMK1（あるいは他の候補遺伝子）について、例えばLIMK1注入胚由来の外胚葉片を伸展刺激するとBMP活性が非注入胚由来外胚葉よりも亢進するか、あるいはMOによるノックダウンでBMP活性の亢進がキャンセルされるか、などを調べることが想定される。
Causes of Carryover	大きな理由の一つは、国際学会（国際ツメガエル学会）、あるいは国内学会（動物学会、鳥取県米子市の予定）への現地参加ができなかったことにある。また、いくつかの試薬について、既存のものを使用することで予定していたほどの消耗品費を計上刷る必要がなかったため、これらについては次年度以降に消耗品費として使用したい。