2022 Fiscal Year Research-status Report

発光タグHiBiTの高機能化・多機能化を通した新規発生遺伝子解析手法の確立

Research Project

Project/Area Number	21K06202
Research Institution	Kochi University of Technology
Principal Investigator	蒲池雄介高知工科大学, 環境理工学群, 教授 (90263334)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	タギング
Outline of Annual Research Achievements	モデル動物におけるゲノム編集技術を用いたノックアウトやノックインによる遺伝子機能の解明が進展しているが、タグの挿入のようなゲノム編集ラインの確立は時間を要するステップである。したがって、一つのペプチドタグを高機能化・多機能化できれば、実験目的ごとのノックインやノックアウトの必要性を低下させ、研究の迅速化につながることが期待される。本研究は、発光タグとして開発されたHiBiTの高機能化・多機能化を通して遺伝子機能の解析の高度化・迅速化をもたらす方法を開発し、これをゼブラフィッシュ胚発生過程における転写因子の研究へと応用することを目的として実施する。 HiBiTタグは、NanoLucの２断片（HiBiTとLgBiT）の相補に基づく発光検出が可能なタグとして開発された11アミノ酸からなるペプチドタグであるが、両者は高い親和性で相互作用し得るため、アフィニティタグとしても利用できる可能性がある。一方、細胞内におけるタンパク質検出にナノボディが利用される場合が近年増加している。そこで、親和性が高いことが知られるALFAタグ-ナノボディ(NbALFA)の組み合わせとHiBiTタグとLgBiTの組み合わせの比較を行うことで、HiBiTとLgBiTの相互作用を利用するシステムの有効性を調べた。ALFAタグ-NbALFAの相互作用を利用したプロテインノックダウンが報告されていることから、HiBiTタグあるいはALFAタグを付加した緑色蛍光タンパク質GFP、F-boxを融合したLgBiTおよびF-boxを融合したNbALFAを用意した。それぞれの組合せをゼブラフィッシュ胚で発現させ、相互作用を通してGFPのタンパク質分解が生じるかを調べた。その結果、いずれの場合も両者の相互作用に依存したGFPの蛍光消失がほぼ同様に観察できたことから、HiBiTとLgBiTの相互作用はALFAタグ-NbALFと同様に利用できることが示唆された。この結果は、HiBiTタグが幅広いin vivo実験で利用可能なことを示唆する。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ゼブラフィッシュの胚内でHiBiTとLgBiTの相互作用に基づいたHiBiTタグの利用が実現可能であること、その相互作用はALFAタグ-ナノボディ(NbALFA)の組み合わせ同様に利用可能なことを示唆する実験結果を得ることができており、今後の実験計画は予定通りに進むことが予想される。
Strategy for Future Research Activity	今後はin vivo実験での利用に加えて、LgBiTを利用したin vitroにおけるHiBiTタグの検出法を確立に注力する。特に、LgBiTを直接蛍光ラベルする方法の有効性を調べる。