2021 Fiscal Year Research-status Report
植物にユニークな膜交通経路は、塩ストレス時になにをどのようにして輸送するのか？
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21K06210
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| Research Institution | Ochanomizu University |
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Principal Investigator |
中村 瑛海 (伊藤瑛海) お茶の水女子大学, ヒューマンライフイノベーション研究所, 特任助教 (80726422)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 膜交通 / 環境ストレス応答 / エンドソーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞内でのタンパク質や膜脂質の配置は、膜交通という物質輸送の仕組みにより決定される。応募者は、植物のみがもつ膜交通制御因子が、植物にユニークな膜交通ルートを制御することで、植物の塩ストレス応答反応に対して重要な役割を果たす可能性を見出した。しかしながら現時点では、この輸送ルートがなにを輸送し、どのようなメカニズムで結果的に植物個体の塩ストレス応答に繋がるのかは明らかでない。本研究では、植物に塩ストレス刺激を与えたときにARA6が輸送する積荷タンパク質、ならびに塩ストレス時にARA6と協調して膜交通を制御するエフェクタータンパク質をプロテオーム解析により網羅的に明らかにする。これにより植物の環境応答に対する膜交通の役割の総合的な理解を深める。
研究計画初年度は、発現ベクターの構築と、解析に用いる培養細胞株の樹立を試みた。エンドソームや液胞膜をラベルするマーカーとして、それぞれのオルガネラに膜貫通領域を介して局在するSNAREタンパク質であるVAMP727とSYP22を選定し、これらをGFP融合タンパク質として発現する遺伝子と、輸送促進型（恒常活性型）、もしくは、輸送抑制型（優性阻害型）ARA6をmRFP融合で発現する遺伝子をタンデムに配置した、pHGW（ハイグロ邁進耐性）、pKGW（カナマイシン耐性）ベクターを構築した。現在、この発現ベクターをシロイヌナズナの培養細胞株である、MM2d細胞に形質転換するための準備と条件検討を進めている。
MM2d培養細胞への形質転換が困難となった場合を想定して、タバコBY2培養細胞株の利用検討や、シロイヌナズナ個体のステイブル系統の作成も進めており、以後のオルガネラ単離実験に使用できる系統の樹立も並行して進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当該研究課題は概ね順調に進展している。
当初の研究計画では、初年度で形質転換培養細胞株の樹立完了を目指しており、作成した発現ベクターの形質転換を複数回行ったが、形質転換株を得ることができなかった。現在、形質転換プロトコールの最適化を行っており、次年度の早い段階で形質転換培養細胞株の樹立が完了する予定である。
また並行して、タバコBY2培養細胞株の利用検討や、シロイヌナズナ個体のステイブル系統の作成も進めており、万が一、MM2d培養細胞株への形質転換が達成できなかった場合でも、計画のバップアップ体制は万全である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、初年度に作成した発現ベクターを形質転換した培養細胞系統、もしくは、シロイヌナズナ形質転換系統を確立し、大量培養により大量に細胞を回収し、GFP抗体を用いた免疫沈降法によるオルガネラ単離を目指す。
同時に研究計画２に着手する。研究2で使用するシロイヌナズナ形質転換系統はすでに作出済みであり、GFP抗体を用いた免疫沈降法による相互作用因子単離についても、条件検討を済ませている。
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| Causes of Carryover |
研究計画初年度では、作成した発現ベクターを形質転換したMM2d培養細胞株の樹立完了を目的としており、作成する複数の培養細胞系統の管理維持、および、2年目に計画した大量培養を目的とした予備的な実験に必要な設備導入や消耗品購入のための経費を計上していたが。しかし、初年度はその前段階であるMM2d細胞の形質転換について詳細な条件検討が必要となり予定していた研究を次年度も引き続き実施することとなったため、初年度に必要な経費として確保していた物品費と謝金が次年度使用額として発生した。
また学会参加費等として計上していた旅費については、新型コロナウイルスの蔓延防止の観点から、当該年度は現地での学会開催が延期となったため、次年度での出張経費として使用額が発生した。
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