2023 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of plant vacuolar trasnport system regulated by RAB5
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21K06222
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| Research Institution | National Institute for Basic Biology |
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Principal Investigator |
海老根 一生 基礎生物学研究所, 細胞動態研究部門, 助教 (90590399)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 液胞輸送 / 膜交通 / RAB |
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| Outline of Annual Research Achievements |
液胞は植物の細胞の中でも貯蔵・分解・空間充填・浸透圧調節など多様な機能を担うオルガネラである。この多様な液胞機能を果たす為に、多くのタンパク質が液胞へと輸送されている。申請者は、モデル植物であるシロイヌナズナにおいて、液胞への輸送経路は少なくとも4つあり、それぞれの経路が異なるタンパク質を液胞へ輸送していること、中でも植物固有の液胞輸送経路が環境応答に関わることを明らかにしてきた。しかしながら、複数の液胞輸送経路にはどのような性質の違いがあるか、液胞輸送経路の多様化は植物において普遍的なものなのか、といった疑問が残されている。本研究課題では、シロイヌナズナを用いて液胞輸送経路の分子メカニズムを詳細に解析し、これを広範な植物種においても解析することで、植物の液胞輸送経路の分子メカニズムと保存性を明らかにすることである。本年度はエンドサイトーシス経路で機能する鍵因子であるRAB5について、共免疫沈降で単離された相互作用候補因子のうち、特に特定の液胞輸送経路にのみ関わると期待される因子について、細胞内局在解析や変異体を用いた詳細な機能解析を進めた。その結果、この因子がRAB５の活性依存的にエンドソーム上に集まること、RAB5・RAB7依存的な液胞輸送経路で機能することを示唆する結果を得た。この他、リン酸化状態を模したVPS9aタンパク質を精製し、その機能解析の準備を進めた。また、プロトプラストを用いた一過的タンパク質発現系を改良し、野生型および変異体において簡便に細胞内局在解析が可能な手法を開発した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の予定どおりRAB5の相互作用候補因子の単離と局在解析を進め、これまで植物において機能解析が行われていなかった因子についても液胞輸送関連因子として単離に成功した。この実験については相互作用候補因子の単離実験の条件検討に時間を要したため、全体的に遅れが生じている。また、本研究課題の目的の一つとして、植物における液胞輸送経路の普遍性の解析が挙げられるが、異種植物のタンパク質を発現させる安定形質転換体の作出は困難であることが多く、昨年度の結果から解析に用いる組織についても検討が必要であることがわかり、当初の予定よりは遅れが生じたが、本年度はこれを解決する方法として一過的タンパク質発現系の改良に成功したため、この実験計画が今後順調に進むと期待できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度の研究を進展させ、新規に単離したRAB5相互作用因子について、詳細な細胞内局在解析と変異体における細胞内輸送異常の解析を進めることで、それらの因子が液胞輸送経路に果たす役割の詳細を明らかにする。また、VPS9aのリン酸化による細胞内局在やタンパク質結合能の変化について詳細な解析を行うことで、細胞内におけるRAB5活性化の時空間的な理解を目指す。また、これらの因子の藻類から陸上植物までの多様な生物種の相同遺伝子を単離し、結合解析と一過的タンパク質発現系での局在解析から機能保存性を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
当初の予定では2021年度に多様な植物種からRAB5およびその相互作用因子の相同因子の単離を行う予定であったが、タンパク質相互作用の解析手法の改良に時間がかかったため、解析に必要な相同因子の特定に時間がかかり、この実験全体に遅れが生じた。また、2022年度の解析から、液胞輸送を理解の上で解析する組織・細胞の違いを検証することの必要性が生じ、異種植物の液胞輸送関連因子の解析についても用いる組織の検証が必要になった。これらの結果から当該実験全体にも遅れが生じたが、2023年度に解析組織と手法の検証が完了したため、2024年度には主にこれらの研究に必要な消耗品と成果報告に助成金を使用する予定である。
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