2022 Fiscal Year Research-status Report
暗黒下におけるエチレン合成依存的・非依存的な葉老化制御機構の解明
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21K06232
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
小塚 俊明 広島大学, 統合生命科学研究科(理), 助教 (20402779)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | フィトクロム / クリプトクロム / エチレン / PIF / ACS |
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| Outline of Annual Research Achievements |
植物は，不要になった器官を積極的に老化することにより，細胞内小器官やクロロフィルなどを分解し，その分解産物を栄養分として回収して新しい器官で再利用する．特に，本葉は光合成遂行の主要器官であるため，暗い日陰では葉老化が誘導される．植物は日陰環境を光受容体によって識別しており，フィトクロム・クリプトクロム下流において葉老化が制御されている．本研究は，葉老化制御に大きく関与する植物ホルモン・エチレンの光受容体による合成制御機構の解明を目的とする．
これまで，エチレン合成律速酵素として知られるACSファミリー遺伝子の中から，フィトクロム下流におけるエチレン合成制御には，ACS8遺伝子が最も重要であることを明らかにした．このACS8遺伝子の発現制御機構を詳細に調べるため，約5kbpのACS8プロモーター配列を単離して，LUC/GUSレポーター解析を実施した．さらに，詳細な遺伝子発現解析から，フィトクロムシグナル伝達因子PIF7によってACS8遺伝子の転写が調節されている可能性が推測された．
令和4年度では，PIF7とACS8プロモーターとの直接的な相互作用による転写制御機構について解析を行った．プロトプラスト細胞によるトランジェントアッセイの結果，ACS8プロモーターの転写活性はPIF7によって直接的に促進されることを示した．さらに，ChIP-PCR解析から，ACS8プロモーター上のG-boxシス配列にフィトクロム不活性化に伴ってPIF7相互作用が促進されることが示された．また，エチレン合成は葉に青色光を照射することによっても抑制される．その際，青色光受容体クリプトクロムがエチレン合成の抑制に関与すること，クリプトクロムシグナルによって葉老化が抑制的に制御されることを明らかにした．この研究成果について，アメリカ植物生物学会が刊行する専門誌に論文発表した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和4年度に計画していた，ルシフェラーゼレポータートランジェント解析とChIP-PCR解析とを予定通り実施した．その結果，bHLH型転写因子であるPIF7がACS8遺伝子のプロモーターに存在するG-boxシス配列に直接的に相互作用して転写を制御することを示した．これらの解析より，本研究計画の中心的な目標となる，避陰応答におけるエチレン合成の促進制御機構において機能するフィトクロムシグナル伝達因子とエチレン合成酵素との関係性を明らかにし，新たなフィトクロムシグナル伝達機構の解明へ向けて大きく前進することができた．
また，ACS8プロモーター:LUCを導入したシロイヌナズナ遺伝子組替体を用いて，スポットライト赤外光LEDによる微小部位照射実験を行った．その結果，ACS8遺伝子の発現は，赤外光照射部位のみで発現が誘導され，それ以外の領域では発現しなかった．この結果より，ACS8遺伝子の発現は器官自律的に誘導されており，輸送シグナルが関与することを示す結果は得られなかった．従って，フィトクロムがPIF7を介して直接的にACS8遺伝子の発現を制御するという上記の仮説を裏付ける結果となった．
さらに，エチレン合成促進の適応的意義を明らかにするため，acs8変異体を用いて避陰応答実験を行った．その結果，興味深いことにacs8変異体は野生型より花成誘導が遅れることがわかり，エチレン合成は避陰応答において花成促進に寄与する可能性が推測された．今後，エチレンが花成を促進するメカニズムを詳細に調べることで，エチレンシグナル伝達による新たな花成制御機構が解明されると期待できる．
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| Strategy for Future Research Activity |
令和5年度では，さらにACS8プロモーター配列を解析するため，ACS8プロモーターのデリーション解析を進める．そのためこれまでに，プロモーター長の異なる5種類のACS8プロモーター配列をそれぞれ組み込んだトランジェントアッセイ用のコンストラクトを作成した．これらのコンストラクトを用いてプロトプラスト細胞によるトランジェントアッセイを実施して，PIF7によるACS8転写活性に必須なプロモーター領域を明らかにする．
さらに，避陰応答においてエチレン合成が花成促進に直接的に関与する可能性を検証するため，全てのACS遺伝子を欠損したacs九重変異体による花成実験や，エチレンシグナル伝達の欠損したein3eil1 二重変異体による花成実験を行う．また，花成誘導に大きく関わるFT遺伝子やSOC1遺伝子の発現解析を行うことで，避陰応答においてエチレンシグナルが関わる花成誘導因子を解析する．
これらの解析結果をまとめることで，フィトクロム下流においてPIF7によるACS8遺伝子の発現制御を介したエチレン合成のメカニズムとその適応的意義を明らかにする．さらに，これらの成果をまとめて学会での発表や，専門誌に論文投稿することにより研究成果を報告する．
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| Causes of Carryover |
計画では，エチレン合成と葉老化の関連性を解析するため大規模なトランスクリプトーム解析を実施する予定だった．しかし，令和4年度の研究成果により，エチレン合成による花成促進制御の可能性が示されたため，実験計画を変更したことが主な理由として挙げられる．
令和5年度には，避陰応答において花成促進制御に関わるエチレンシグナル伝達機構を解析するため，様々な光生理実験を計画しており，それらの単色光照射実験機器の購入や，遺伝子発現解析のための研究費として，次年度使用額として生じた助成金を使用する予定である．
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