2022 Fiscal Year Research-status Report
緑藻スジアオノリ配偶子の微細な性差から解く、細胞間の相互認識と融合の仕組み
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21K06242
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
市原 健介 北海道大学, 北方生物圏フィールド科学センター, 助教 (60610095)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 有性生殖 / アロ認証 / 海藻 / ゲノム編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、アオノリ配偶子間の「認識」と「融合」に重要な役割をもつタンパク質の実体と機能を明らかにすることを通して、雌雄性というものがどのような構造の違いや性質の違いから始まったものであるかを明らかにすることである。当該年度は以前行ったスジアオノリ雌雄配偶子の細胞膜および鞭毛のプロテオーム解析の結果から、配偶子間の「認識」と「融合」に関与すると思われるタンパク質を探索した。アノテーション用のデータベースには雌雄配偶子の形成過程で経時的にサンプリングしたRNAseqの結果をde novo assemblyしたものを利用した。解析の結果、鞭毛からは緑藻クラミドモナスで発見された鞭毛に存在し、雌雄や種の認識に機能すると考えられているアグルチニン様タンパク質が発見された。また、雄の細胞膜に特異的なタンパク質として、植物の受精因子として知られるGEX2遺伝子のホモログも発見することができた。
今年度は新たに雌雄配偶子形成過程の細胞からRNAを抽出し、stranded RNAseqを行った。この実験と、前年度ゲノム支援で得られたIso-seqデータを利用することで、より正確な遺伝子モデルを予測する事ができた。またゲノム編集を利用したノックイン実験系の開発を試みたところ、長鎖の一本鎖DNAを利用することで、GEX2のC末端側にEGFPを付加することに成功した。今後はこのゲノム編集個体を利用して、GEX2の局在、また細胞融合の雌側因子の探索を行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
昨年度発見した雌側の候補因子（膜貫通ドメインを持つEGF-domainを含むタンパク質やLeucine-Rich Repeatsを持つキナーゼ等）について、ゲノム編集でノックアウト変異体を作成したが、接合子形成に関して、顕著な表現型は確認できず、細胞融合には関与していない事が示唆される結果が得られた。また上述のGEX2-EGFPノックイン変異体は作成直後は藻体の生長が芳しくなく、EGFPの挿入はシーケンスから確認できているが、配偶子での発現が確認できていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
GEX2にEGFPを挿入した株については、現在生育が良好になってきており、来年度に発現の確認、局在確認までは達成できる見込みである。またGEX2-EGFPをバイトとした雌側因子の探索にも取り組める予定である。
雌側の配偶子融合因子の探索のために、今年度おこなったstranded RNAseqの結果を利用し、より正確な遺伝子モデルの構築、発現解析を行い、膜タンパク質プロテオームの結果と合わせて解析することで、新たな候補遺伝子の探索も同時に進める予定である。
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| Causes of Carryover |
実験計画に多少の遅れが生じたために、それに伴い予定していた試薬などの購入を延期したために次年度使用額が生じた。来年度は遅れていた実験を行うため、全体としのは計画に相違はない。
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Research Products
(2 results)
