栄養飢餓に応答したタンパク質バルク分解を担う新奇オートファジー経路の解明

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K06243
• Research Institution: Saitama University
• Principal Investigator: 森安 裕二 埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (20200454)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 金子 康子 埼玉大学, 教育学部, 教授 (30194921) ; 井上 悠子 埼玉大学, 理工学研究科, 助教 (40637922)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: オートファジー / タバコBY-2細胞 / シロイヌナズナ培養細胞 / ヒメツリガネゴケ / タンパク質分解 / 細胞死

Outline of Annual Research Achievements

(1)新奇オートファジーを行う膜小胞が液胞に由来することを明らかにする目的で、液胞膜タンパク質Vam3とGFPとの融合タンパク質を恒常的に発現しているBY-2細胞をショ糖飢餓培地で培養し、落射蛍光顕微鏡で細胞質の蛍光膜小胞を探した。液胞以外にGFPをもつ小胞は見つかるものの、経時変化を観察してもこれらの小胞と新奇オートファジーの関係はわからなかった。一方で、ショ糖飢餓条件下で培養した細胞の液胞膜の形態に変化が現れることを見出した。Vam3-GFP蛍光はショ糖飢餓処理前には液胞膜を染色していたが、ショ糖飢餓12 h後には、GFP蛍光をもつ液胞膜が厚く見えるようになった。電子顕微鏡観察は、同時間帯に、近傍に多数の小胞を伴う液胞膜が頻度高く観察された。このことは、ショ糖飢餓条件下では液胞膜から膜小胞が出芽したり液胞膜に膜小胞が融合する事象が頻繁に起こっていることを示唆している。(2)新奇オートファジー経路とミクロオートファジー経路は、どちらも細胞質を液胞内に輸送するという点で似ており、区別するのは難しいと予想された。そこで、ショ糖飢餓処理後の細胞質顆粒の経時変化を調べ、新奇オートファジーが始まると予想されるショ糖飢餓1日後に、液胞に運ばれる細胞質顆粒が増えることを明らかにした。それに合わせて、液胞内で観察されるミトコンドリアの数も増えることを明らかにした。(3)シロイヌナズナの野生株とATG遺伝子破壊株(atg2株とatg5株)の芽生えの胚軸組織より作製した液体培養細胞の培養を続けた。これらの培養細胞は細胞塊が大きく、そのまま顕微鏡観察するのが難しいという短所をもっていたが、本年度は、細胞塊の小さい細胞を選抜するように植継ぎを続けて、徐々に細胞塊の小さな培養細胞が得られてきている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

タバコBY-2細胞とシロイヌナズナ培養細胞を用いた実験が問題なく進行したものの、計画していた実験をすべて完了できなかった。

Strategy for Future Research Activity

実験材料にヒメツリガネゴケを加える。
タバコ培養細胞では、新奇オートファジーのすぐ後に細胞死が起こる。よって、新奇オートファジーと細胞死には関係があると想像される。一方で、ヒメツリガネゴケではマクロオートファジー欠損株を作製しており、それらを用いて、マクロオートファジー経路と細胞死が密接に関連していることが示されている。そこで、ヒメツリガネゴケの細胞死の前後において、タバコ培養細胞で仮定されている新奇オートファジー経路に相当する膜動現象が起きていないかを調べる。

Causes of Carryover

実験消耗品の使用量が予想を下回ったので、次年度使用額が生じた。
次年度に行う実験の消耗品の購入や論文投稿料に回して使用する。