2021 Fiscal Year Research-status Report
陸上植物に保存された葉緑体ペプチドグリカン関連タンパク質SLHの解析
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21K06251
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
武智 克彰 熊本大学, 大学院先端科学研究部(理), 准教授 (70515501)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高野 博嘉 熊本大学, 大学院先端科学研究部(理), 教授 (70242104)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 葉緑体内部構造 / 葉緑体ペプチドグリカン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
PpSLHsタンパク質の局在及び機能ドメイン解析
4種のPpSLHsの推定アミノ酸配列から，推定葉緑体移行配列，天然変性領域，膜貫通ドメイン，SLHドメイン，coiled-coil構造をもつことが推測された。移行配列とsGFPを用いた局在解析の結果，葉緑体に移行することは明らかになっていたものの，葉緑体内での局在は不明だったので，局在解析を行った。PpSLHsは膜貫通ドメインを持つことから，ペプチドグリカン（PG）と関連するのであれば，内包膜を貫通し，包膜間のPGと相互作用していると予想される。そこでPpSLHsの全長とsGFPの融合タンパク質を発現させ，細胞内での局在を解析したところ，PpSLHsは葉緑体周辺部にドット状に局在していた。次に各ドメイン構造をそれぞれ除いたPpSLHsとsGFPの融合タンパク質を発現させたところ，膜貫通領域を除くとドット構造は消失し，包膜間付近に一様に局在することから，膜貫通ドメインの存在によって，包膜上に集積することが分かった。また膜貫通領域からC末端までの配列を除くと，包膜付近に局在が見られなくなったことから，これらのドメイン内で他のタンパク質と相互作用し，包膜間の局在に関与しているのではないかと考えられた。またPpSLHs全長sGFPを，PpSLH4重遺伝子破壊ラインで発現させると，葉緑体内の巨大小包膜上にもシグナルが観察された。このことから巨大小胞膜は，包膜由来の可能性が示唆された。
AtSLHsによるPpSLH4重遺伝子破壊ラインの相補解析
シロイヌナズナに保存された3種類のAtSLHsをPpSLH4重遺伝子破壊ラインで一過的に発現させたところ，AtSLH3では，PpSLH4を発現させた時と同様に，異常葉緑体数の減少が確認された。シロイヌナズナ変異体では，葉緑体の異常は観察されていないが，AtSLHは機能分化している可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ヒメツリガネゴケのPpSLHsの葉緑体内局在とタンパク質の各ドメインの機能を，sGFPを用いて解明し，おおよその局在の見当を付けることができた。バクテリアにおいて，SLHドメインを持つタンパク質は，ペプチドグリカン（PG）と結合することが知られているが，初年度の目標であった，PpSLHsとPGの結合解析までは行うことができなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度は，ペプチドグリカン（PG）とPpSLHsとの結合能を解析する。AtSLH3も，PpSLH4重遺伝子破壊ラインの異常葉緑体表現型を相補できたことから，PpSLHsがPGと結合するのであれば，AtSLHも結合するのかもしれない。また，エストラジオールによる条件的遺伝子発現系を用いて，PpSLH4重遺伝子破壊ラインでPpSLHsの発現を誘導することで，異常葉緑体の小胞の消長がどのように生じるのかを，詳細に観察することで，小胞形成のメカニズムにせまりたい。またPpSLHs変異体は，異常葉緑体を生じるものの，植物の生育には致死的な影響は見られない。コケは環境ストレスに対して，頑強な性質をもつことが知られており，そのために生育への影響が強くでていないのかもしれない。そこで，塩ストレスや浸透圧ストレス，または植物のストレスホルモンであるABAを処理することにより，小胞の消長を調べる。また，ヒメツリガネゴケのPG分解系遺伝子破壊ラインでは，いずれも巨大葉緑体が生じることを明らかにしているが，これらの変異体においても，PpSLHs4重遺伝子破壊ラインと類似した葉緑体小胞が観察される。このことは，PGとSLHsの関連を示すものであり，PGと小胞の形成には関連があるのかもしれない。そこで，３種類のPG分解系遺伝子破壊ラインで，PpSLHs遺伝子を過剰発現させることで，巨大葉緑体内の小胞が減少するかを調査する。また，異常葉緑体内の小胞膜及び小胞内部構造が，葉緑体のどの部位由来なのかを明らかにするために，葉緑体の外包膜，内包膜，包膜間，チラコイド膜，ストロマに局在することが分かっているタンパク質をsGFPでラベルし，PpSLH4重遺伝子破壊ラインに導入することで，小胞の由来を明らかにしたい。
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