2022 Fiscal Year Research-status Report
Centrioleの自己複製における鋳型の意義の解明
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21K06257
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| Research Institution | Hosei University |
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Principal Investigator |
広野 雅文 法政大学, 生命科学部, 教授 (10212177)
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2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 基底小体 / トリプレット微小管 / SAS-6 / Bld10p |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の到達目標は、微小管の数が正常な9本ではなく6本や7本などの大きく異なる数の中心子を形成するクラミドモナス株を作出し、そこから形成される娘中心子の微小管数を計測し、母中心子の鋳型としての役割を解明することである。そのために、１）母・娘中心子ペアの微小管数を計測する技術と、２）微小管数が異常な中心子を正常な細胞質中で複製させる技術を開発する必要がある。
１）については、昨年度は、集束イオンビーム（FIB）加工を用いたSEM観察によって三次元構造の再構成を試みたが、微小管数が判別できるほどの解像度の画像を得ることはできなかった。そこで今年度は、単離した母・娘中心子ペアの微小管を蛍光タキソールで可視化し、それらを膨張顕微鏡法（Expansion microscopy）で観察することを試みた。膨張顕微鏡法は、試料をゲルに包埋して膨張させてから観察する方法で、中心子の微小管数が判別できることが報告されている。現在は単離中心子をゲルに包埋する条件などを検討中である。今後はこの方法で母・娘中心子間の微小管数の相関を検討する予定である。
２）については、クラミドモナスの接合現象を利用して、遺伝子操作によって微小管数が異常になった細胞と野生型細胞を融合する方法を検討していた。しかし、細胞融合後に二倍体細胞として増殖する細胞の割合がごくわずかであることが判明し、そのような細胞を追跡することが困難であることが明らかとなった。今後は、細胞周期の同調が容易なクラミドモナス株（C239株）を用い、中心子複製期の細胞質を調製して、中心子のin vitro複製の可能性を探る予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
透過型電子顕微鏡を用いたトモグラフィーで母・娘中心子ペアのそれぞれの微小管数を計測する予定であったが、未だに導入されていないため、FIB-SEMなどを試みたが、それもうまくいかなかった。現在、膨張顕微鏡法という別な方法を試みているが、経験のない方法であるため、条件検討などに時間を要している。
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| Strategy for Future Research Activity |
単離した母・娘中心子ペアの微小管を蛍光タキソールを用いて可視化し、膨張顕微鏡法で観察することにより、それぞれの微小管の数を判別する方向で作業を進めている。この方法で微小管数が判別できれば、母・娘中心子ペアの例数を確保することは容易であるため、研究計画が大きく進捗することが期待できる。
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| Causes of Carryover |
母・娘中心子のFIB-SEM観察の費用を協力先が負担してくれる状態が続き、その後、2022年度の後半に膨張顕微鏡法に切り替えた。そのため、厚切り樹脂切片の調製のための費用として予定していた分が2022年度も未使用となった。2023年度には膨張顕微鏡法による観察を本格化させるため、この費用はそのために使用する予定である。
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