2021 Fiscal Year Research-status Report
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21K06279
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
田上 英明 名古屋市立大学, 大学院理学研究科, 准教授 (70273216)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | Mlo2 / ヒストンH3 / 複合体解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
クロマチン構造は、様々な細胞機能と関連してダイナミックに変化しながらもエピジェネティクス情報とともに安定に維持される。このクロマチン動的制御の破綻は、ゲノム不安定化を誘引し、がんなどの多くの疾患との関連性も示唆されている。本研究「ヒストンH3-H4の解離制御と生理機能」では、申請者が見いだした新規H3結合因子Mlo2が安定なヒストンH3-H4を解離させる活性を持つことに焦点を当て、クロマチン動的制御と細胞機能との連携システムの解明を目指すものである。H3結合活性を持つユニークなMlo2 C末端領域に焦点を当てH3結合・H4解離活性を明らかにすることを計画している。また、ヒストンH3, H4についても点変異を導入して、Mlo2との結合部位や、H3-H4結合解離の分子機構を明らかにしたい。
令和3年度において、分裂酵母Mlo2 C末端領域について、NMRにより示唆された二量体形成に重要と考えられる部位にアラニン置換変異を導入した。それら点変異体の過剰発現時の表現型および二量体形成、ヒストンH3との結合活性について解析を行った。その結果、それらの変異はMlo2過剰発現時の増殖阻害を抑圧することが明らかとなり、細胞内での機能が示唆された。in vitro解析では、Mlo2 C末端領域の二量体形成に関与するいくつかの部位がH3結合に重要であることを明らかにし、それらの関連性が示唆される。
さらに、H3のMlo2結合部位についても点変異解析を行い、H4との相互作用部位であるY99がMlo2結合にも重要であることが示された。H3-H4二量体（四量体）とH3-Mlo2結合との関連性について、さらに解析を進める予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Mlo2 C末端領域にアラニン置換変異を導入し、分裂酵母内で過剰発現する系を構築した。それらを用いて、過剰発現時の表現型解析を行い、C末端変異体のいくつかはMlo2過剰発現時の増殖阻害を抑圧することが明らかとなった。また、それら点変異体のC末端領域を精製し、in vitroで二量体形成、ヒストンH3との結合活性について生化学的解析を行った。その結果、二量体形成に関与するいくつかの部位がH3結合に重要であることを示した。
さらに、H3のMlo2結合部位についても点変異を導入し、in vitroでMlo2 CTDとの相互作用について解析した。その結果、H4との相互作用部位であるY99がMlo2結合にも重要であることが示された。
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| Strategy for Future Research Activity |
Mlo2 C末端領域の二量体形成について、ゲル濾過だけでなく別の手法で確認を進めるとともに、全長Mlo2の二量体形成について解析を進める。Mlo2 C末端領域とH3との相互作用についても、カロリーメーターによる定量解析、およびNMR解析のためのサンプル調製を試みる。
Mlo2 N末端のユビキチンリガーゼドメインの機能とC末端領域の二量体形成やH3結合との関連性について、生化学的および分子遺伝学的解析を進めることで、Mlo2の分子機能を明らかにしたいと考える。
また、ヒストン過剰発現系におけるMlo2変異の関与や、他の関連因子を含めヒストンバランス破綻時の危機管理システムについて解析を進める予定である。
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