2022 Fiscal Year Research-status Report
Morphological study of extant lycophytes to elucidate evolution of branching system in vascular plants
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21K06316
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| Research Institution | Kyoto University of Education |
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Principal Investigator |
藤浪 理恵子 京都教育大学, 教育学部, 准教授 (40580725)
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2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 根 / 茎 / 頂端分裂組織 / 維管束植物 / 分枝 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
植物の分枝の起源は古く、初期の維管束植物がまだ根、茎、葉をもたない時代にすでに、軸が単純に二又状に枝分かれしていた。分枝は植物がもつ最も基本的な体制であるが、祖先的な分枝が１本の軸からどのように生じたのかは不明である。分枝出現後、根、茎、葉が進化して多様な維管束植物が進化したことから、植物の形態進化に分枝は重要な形質である。初期の分枝の仕組みを解明するために、鍵を握るのがシダ植物小葉類である。現生の維管束植物のうち、原始的な二又分枝をもつのは小葉類で、初期の維管束植物の姿を残している。本研究はシダ植物小葉類の根と茎の分枝形成の制御機構を解明すること目的とし、分枝形成に重要な役割を担うと多くの知見がある植物ホルモンのオーキシンを用いた解析を行い、根と茎のオーキシン応答やその局在について発生解剖学的手法と分子遺伝学的手法から解析する。本年度は、ヒカゲノカズラと同じヒカゲノカズラ科に属し、根頂端分裂組織の構造が異なるトウゲシバを用い、合成オーキシン（NAA）、オーキシン輸送阻害剤（NPA）を各々0.2－100 μMの濃度で、根端と茎頂部分に局所的に塗布し、投与による成長と頂端分裂組織（RAM）の細胞分裂動態を解析した。その結果、NAA投与個体では根の伸長がみられ、NPA投与個体では根の伸長阻害がみられた。さらにEdU蛍光染色法を用いてRAMの細胞分裂動態を解析した結果、NPA投与後１日目からRAM全体の細胞分裂頻度が低下することが明らかとなった。したがって、トウゲシバはヒカゲノカズラと同様に、根頂端部へのオーキシン輸送が阻害されることにより、RAM全体の細胞分裂が抑制されると考えられる。RAM構造の維持にもオーキシンが関与することが示唆された。今後、小葉類の根の成長におけるオーキシンの影響をさらに解析する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度はヒカゲノカズラ科トウゲシバのオーキシン処理実験およびヒカゲノカズラとトウゲシバの根と茎を用いた抗IAA抗体による免疫組織染色実験を実施した。植物試料は、野外で5月から12月にかけて定期的に採集し、人工気象器内で育成して各々の実験に用いた。トウゲシバのオーキシン処理実験では、NAAとNPAを各々0.2－200 μMの濃度で根に投与し、根の成長への影響を約1カ月間、観察を行った。その結果、NAA投与個体では根の伸長が促進されるという傾向がみられた。一方、NPA投与個体では著しく根の伸長が抑制された。NPA投与時の根の伸長抑制から、根頂端分裂組織にどのような影響が生じているのか明らかにするため、分裂細胞を標識するEdU試薬による細胞分裂動態解析を行った。トウゲシバの根頂端分裂組織はヒカゲノカズラとは異なり、根頂端部に静止中心様領域はもたず、複数始原細胞群が層状を成す。NPA投与の根では、処理後１日目から根頂端分裂組織全体のEdU取り込み細胞が減少し、対照区と比較して約1/3倍の分裂頻度を示した。さらに、7日目以上の個体では根冠の細胞層が減少し、根頂端分裂組織の領域が著しく縮小していた。これらの結果から、トウゲシバの根先端部でオーキシンの極性輸送を阻害した場合、根頂端分裂組織の細胞分裂が抑制され、構造が維持されなくなる可能性が考えられる。したがてって、小葉類トウゲシバの根頂端分裂組織の構造維持には、種子植物と同様のオーキシンの機能をもつ可能性が推測される。また、本年度から既存の抗IAAポリクローナル抗体による免疫染色法でヒカゲノカズラとトウゲシバの根のオーキシン局在の解析を実施している。ヒカゲノカズラとトウゲシバの茎頂分裂組織及び根頂端分裂組織でIAA抗体の局在が顕著にみられており、より詳細な条件検討を行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
シダ植物小葉類の根頂端分裂組織（RAM）の構造は4タイプあり、これまでQC領域をもつヒカゲノカズラと、ＱＣ様領域をもたないトウゲシバについて解析を進めてきた。次年度では、上記２種の小葉類に加え、RAMに１つの頂端細胞をもつコンテリクラマゴケでも根にNAAとNPAなどの試薬投与を行い、その成長変化とEdU蛍光染色法による細胞分裂動態を調べ、小葉類全体でオーキシンとRAMとの関係性を明らかにする。免疫抗体法を用いたオーキシン局在解析については、ヒカゲノカズラとトウゲシバの根と茎を用いて既存の抗IAAポリクローナル抗体による予備的実験を行い、解析準備が進んでいる。来年度はヒカゲノカズラとトウゲシバ、コンテリクラマゴケの根と茎を用いた抗IAA抗体によるオーキシン局在解析をさらに進める。茎の解析に関しては、抗IAA抗体による免疫抗体法に加え、HistoneH4相同遺伝子によるISH法解析を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
本年度は、昨年度に引き続き小葉類のオーキシン投与実験を中心としたEdU蛍光染色法の解析に重点をおいた解析を行ったため、実験室内での培養実験のための実験器具類、試薬などの購入を行った。その成果として小葉類の根の構造維持にオーキシンが重要な働きを担う可能性を示唆することができている。さらに、本年度から着手した免疫抗体法を用いたオーキシン局在解析は、小葉類では初めての試みのため植物試料の準備や実験の条件検討に多くの時間を要した。一方で、細胞分裂動態解析のISH法のプローブ作成および必要な試薬と器具類の準備を十分に行うことができなかった。次年度ではオーキシン局在解析とISH法に用いる必要な物品を購入し、さらに実験を進める予定である。
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