2023 Fiscal Year Research-status Report
Morphological study of extant lycophytes to elucidate evolution of branching system in vascular plants
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21K06316
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| Research Institution | Kyoto University of Education |
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Principal Investigator |
藤浪 理恵子 京都教育大学, 教育学部, 准教授 (40580725)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 根 / 茎 / 分枝 / 維管束植物 / 頂端分裂組織 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
植物の分枝の起源は古く、初期の維管束植物がまだ根、茎、葉をもたない時代には軸が単純に二又状に枝分かれしていた。分枝は植物がもつ基本的な体制であるが、祖先的な分枝がどのように生じたのかは不明である。分枝出現後、根、茎、葉が進化したことから、植物の形態進化に分枝は重要な形質と考えられる。現生の維管束植物のうち、原始的な二又分枝をもつのはシダ植物小葉類のみで、小葉類の形態進化を明らかにすることは植物進化解明にとって不可欠である。本研究は、シダ植物小葉類の根と茎の分枝形成の制御機構を解明すること目的とし、分枝形成に重要な役割を担うと多くの知見がある植物ホルモンのオーキシンを用いた解析を行い、根と茎のオーキシン応答やその局在について発生解剖学的手法と分子遺伝学的手法から分枝の形態進化について明らかにする。小葉類ヒカゲノカズラ科のヒカゲノカズラとトウゲシバを用い、合成オーキシン（NAA）、オーキシン輸送阻害剤（NPA）を根端と茎頂部分に局所的に投与し、各々の成長と頂端分裂組織の細胞分裂動態を解析した。その結果、NPA投与個体の根では、根の伸長阻害とRAM全体の細胞分裂頻度の低下、RAMの縮小や構造の変化が生じ、NAA投与の根は伸長が促進されることが明らかとなった。これらの結果から、ヒカゲノカズラとトウゲシバのRAM構造の維持にオーキシンが機能すると考えられる。さらに、根と茎のオーキシン局在を抗IAA抗体による免疫染色法とPIN相同遺伝子による発現解析を行い、分枝形成時のオーキシン局在を解析し、分枝形成の機構解明を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
小葉類ヒカゲノカズラ科のヒカゲノカズラとトウゲシバを用いてオーキシン投与実験及び抗IAA抗体による免疫染色法を行い、根と茎の形態形成におけるオーキシンの影響を解析した。２種のオーキシン投与実験は合成オーキシン（NAA）とオーキシン輸送阻害剤（NPA）を各々の根頂端部に投与し、根の成長への影響を約１か月解析した。その結果、NAA投与の場合、２種とも根の伸長が促進され、NPA投与では著しく根の伸長が抑制されるということが明らかとなった。NAAとNPA投与時ぼ２種の根頂端部の細胞分裂動態の変化を明らかにするために、分裂細胞を標識するEdU蛍光試薬を用い、RAMの分裂動態解析を行った。ヒカゲノカズラの根頂端分裂組織（RAM）は通常、根頂端部に静止中心（QC)様領域をもち、その周辺の細胞群は盛んに細胞分裂を行う。NPA投与の根では、処理後2日目からRAM全体のEdU取り込み細胞が減少し、3日目以降ではQC様領域と同程度の分裂頻度を示した。7日目以降、根冠の細胞層が減少し、根頂端分裂組織の領域が著しく縮小した。トウゲシバのRAMではヒカゲノカズラとは異なりQC様領域をもたないが、NPA投与のRAMの分裂頻度はヒカゲノカズラと同様に著しく減少し、RAM領域自体が縮小していた。これらの結果から、２種の根頂端部でオーキシンの輸送を阻害した場合、根頂端部の細胞分裂が抑制され、正常な構造の維持がされなくなったと考えられる。したがって、ヒカゲノカズラとトウゲシバのRAM構造維持にはオーキシンが必要であると示唆される。さらに、根と茎の分枝形成時のオーキシン局在解析のために抗IAA抗体による組織学的解析を行った。根と茎の頂端部全体に抗IAA抗体の局在がみられたが、細胞ごとの抗IAA抗体の分布を明確に可視化できなかった。そこで、オーキシン排出輸送タンパク質のPIN相同遺伝子の発現解析を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
ヒカゲノカズラとトウゲシバの根と茎の成長と分枝形成に関与するオーキシン局在を解析するために、オーキシン排出輸送タンパク質であるPIN遺伝子を用いた発現解析を行う。シダ植物小葉類のイワヒバ科において、数個のPIN遺伝子の発現解析が行われており、茎の分枝にオーキシンの関与が示唆されている。これらの知見をもとに、ヒカゲノカズラ科の根と茎のPINの局在を解析し、根と茎の分枝の各発生段階におけるオーキシンの動態を明らかにする。ヒカゲノカズラとトウゲシバのPIN相同遺伝子の単離は、現在、数個の単離を完了している。PIN相同遺伝子の発現解析を進め、ヒカゲノカズラとトウゲシバの分枝形成のオーキシンの機能を推定するとともに、軸の二又分枝の形成機構について議論し、成果報告を行う。
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| Causes of Carryover |
根と茎の頂端部に分布すると予測されるオーキシンの局在を可視化するために、抗IAA抗体を用いた免疫染色法を実施していたが、実験条件を設定することが非常に困難であった。そのため、免疫染色法よりも時間は要するが、目的とするオーキシン局在とその動態を解析するのに適していると考えられる、オーキシン排出輸送タンパク質のPIN遺伝子の発現解析をRNA in situ Hybridizatino法で行いこととした。発現解析には、目的遺伝子の単離、プローブ作成、固定植物試料を作成する必要があるが、実験に必要な植物体は4-8月の成長期に入手する必要があったため、次年度に各実験を行う必要性が生じた。次年度、生育地で植物試料を採集し、単離できていないPIN相同遺伝子の数個をヒカゲノカズラとトウゲシバで解析し、発現解析のために作成する切片試料として植物体の固定を実施し、発現解析を行う予定である。
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