2021 Fiscal Year Research-status Report

睡眠時のNO産生細胞の活動による可塑性の制御機構の解明

Research Project

Project/Area Number	21K06384
Research Institution	National Institute for Physiological Sciences
Principal Investigator	林健二生理学研究所, 基盤神経科学研究領域, 助教 (50512349)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	一酸化窒素 / 睡眠
Outline of Annual Research Achievements	臨界期のNOS1陽性細胞およびNOの機能に関して、「睡眠との関わり」と「可塑性に対する機能」を主眼として研究を進める。本研究は ①NOS1陽性細胞の睡眠時の活動性および、周囲の細胞への作用に関する解析を行う。また、可塑的な変化への関与を明らかにするために、②睡眠時活性化型のNOS1陽性細胞の活動操作による眼優位性シフトへの影響を解析する。さらに、NO感受性と可塑的変化の強度との関係を明らかにするために、③NO感受性と眼優位性シフトの強さに対する相関解析を行う。本年度はまず内在性のNOS1の機能を評価するための実験系の構築を行った。AAVを用いたTetシステムベースのDREADDでNOS1細胞にhM4Diを発現させたところ、アゴニスト依存的にNOS1細胞の活動抑制を行うことができた。また、NOS1細胞の活動抑制に伴い、周囲の細胞の自発活動レベルが増強することが分かった。このことは定常状態時に大脳皮質の興奮性細胞の活動性がNOにより制御されていることを示唆する。今後、睡眠時に活動性を亢進させる細胞サブタイプを同定し、細胞サブタイプ特異的に活動抑制を行うことで睡眠時のNOS1の機能を明らかにしていきたい。次に、NO感受性と眼優位性シフトの強さに対する相関解析のための予備実験のために、FOV内の各細胞のNO感受性の評価を行った。NOS1細胞のhM3Dqによる活性化により周囲の細胞の視覚応答性は低下する。そこでアゴニスト刺激前後での視覚応答性の変化を解析した。視覚応答性の低下の程度は細胞ごとに大きくバラついており、またその程度とNOS1細胞からの距離には関係がないことから、各興奮性細胞のNOの感受性には多様性があることが示された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 本年度は主として「可塑性に対する機能」を主眼として研究を進めてきた。睡眠時活性化型のNOS1細胞の活動操作を行うために、NOS1細胞のDREADDの実験系の改変および評価を行った。内在的なNOS1の機能を評価するためにはDREADD Giによる細胞の活動抑制を行う必要があるため、AAVを用いたDREADDシステムを改変した。GCaMP7fを用いて細胞の活動を評価したところ、DREADDアゴニストの投与によりNOS1細胞の活動抑制が見られることが分かった。また、それに伴い、周囲の細胞の自発活動が増加していることが明らかとなった。このことは、NOが定常状態で周囲の細胞の活動性レベルを一定に保つ可能性を示唆している。本研究では、睡眠時に放出されるNOに対して、周囲の細胞のNO感受性と可塑的変化の強度との関係を明らかにしたい。本年度では、まず各細胞のNO感受性を評価した。NOS1細胞のDREADDアゴニストによる活性化により、急性に周囲の細胞の視覚応答性が低下する。活性化前後の応答性の比率を評価したところ、応答性の低下には細胞ごとに大きなばらつきがあること、またNOS1細胞からの距離には相関がないことが明らかとなった。
Strategy for Future Research Activity	来年度からは「睡眠との関わり」に関して積極的に解析を行う予定にしている。NOS1陽性細胞のうちType Iは前脳基底部のコリン作動性ニューロンによりNREM睡眠時に活性化するが (Pasumarthi 2010)、従来のようなc-Fos染色を用いた解析では、覚醒/NREM睡眠/REM睡眠の各相での活動変化や、他の細胞との関係を評価することは難しい。そこでin vivoイメージングと同時にEEG, EMG測定を行い、各相における自発活動を解析する。Type I以外のNOS1陽性細胞サブタイプが睡眠時に活動性を変化させる可能性を検証するために、記録後にAbScaleによる透明化および各種細胞マーカーの染色、イメージングFOVとの位置合わせを行い、サブタイプごとの睡眠時の活動を解析する。
Causes of Carryover	実験系の確立に時間がかかり、当初の計画より研究の遅延が生じたため。生じた遅延分の研究は令和４・５年度に行う。