2022 Fiscal Year Research-status Report

Visualizing the process in retrieval of synaptic vesicles

Research Project

Project/Area Number	21K06393
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	田中洋光京都大学, 理学研究科, 助教 (30705447)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	全反射顕微鏡 / Neurexin / シナプス小胞 / エンドサイトーシス / シナプス形成
Outline of Annual Research Achievements	シナプスにおける神経情報伝達は、活動電位の到達直後にシナプス前終末から行われ、高頻度の活動電位にも対応する。この情報出力を可能にするために、シナプス前終末にはタンパク質が密に集積した「アクティブゾーン」と呼ばれる細胞膜領域があり、シナプス小胞を効率的に開口放出して再構成する仕組みがあると考えられている。しかしながら、アクティブゾーン周辺でどのようにシナプス小胞が放出して取り込まれ、機能的な小胞が再構成されるのかは未だ明らかでない。研究代表者はこれまで、神経伝達物質受容体の動態やシナプス小胞の開口放出を、全反射顕微鏡を用いて高時空間分解能でライブイメージングできる独自の実験系を構築してきた。 2022年度では、その実験系を用いてラットの海馬神経細胞に、pH感受性GFPであるSEPを融合させた小胞構成膜タンパク質Synaptophysinを、遺伝子導入により発現させた。そして活動電位を誘発する電場刺激を細胞に加えて、シナプス前終末からシナプス小胞を放出させて、エンドサイトーシスされたSynaptophysinをライブイメージングした。解析の結果、即時可能なシナプス小胞の大半を放出させるような刺激では、バルク型エンドサイトーシスとクラスリン依存型エンドサイトーシスが主に駆動され、数個程度の小胞を放出させるような刺激では、超高速型のエンドサイトーシスが駆動されることが明らかとなった。後者は温度依存性でもあり、準生体温下では駆動される一方、室温下では駆動されなかった。また、各型のエンドサイトーシスで取り込まれたSynaptophysinの位置や輝度分布を解析し、エンドサイトーシスの特徴を初めて抽出できた。これにより、高速の情報出力が実現される神経情報伝達機構の解明に貢献した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 当初の目的通り、各型のエンドサイトーシスを可視化してその特徴を抽出できた。本研究の成果は、日本神経科学学会において口頭発表し、海外でも講演した。近日中に論文投稿する状況から、おおむね順調に進展していると考えている。
Strategy for Future Research Activity	本研究により個々のシナプスにおいて、シナプス小胞の取り込み形態や場所は一様ではなく、刺激ごとに異なることが明らかになりつつある。そこで今後は、繰り返し刺激による機能的な小胞の再構成の動態について研究する。また、本実験系の定量性が高い点を利用して、SEP1分子由来の輝度を元に、各型のエンドサイトーシスの取込量を比較する。
Causes of Carryover	次年度に論文投稿予定、及び実験に必要な比較的高価の消耗品、備品を購入予定のため、一部繰越した。