2021 Fiscal Year Research-status Report
USが先行する条件付け抑制にMg2+ blockが果たす役割
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21K06402
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science |
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Principal Investigator |
宮下 知之 公益財団法人東京都医学総合研究所, 脳・神経科学研究分野, 主席研究員 (70270668)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 古典的条件付け / 順行条件付け / 逆行条件付け / NMDA受容体 / Mg2+ block / dopamine |
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| Outline of Annual Research Achievements |
パブロフの発見した古典的条件付けでは、条件刺激(conditioned stimulus: CS)と同時若しくは後に無条件刺激(unconditioned stimulus: US)が提示される順行条件付けは条件付けが成立する。しかし何故 US が CS に先行する逆行条件付けでは条件付けが成立しないのか?そのメカニズムについては全く明らかになっていない。研究代表者は、電気ショックの情報が記憶中枢であるキノコ体（MB)を囲むグリア細胞からグルタミン酸によって伝えられること、MBへの電気ショック情報の入力は、MBに発現するNMDA 受容体(NR)のMg2+ blockによって制御されていることを見出した。NRの Mg2+ blockのショウジョウバエ変異体(NRMg-/-)で、順行条件付けだけでなく、逆行条件付けでも条件付けが成立する事を見出した。連合学習の成立には、匂いと電気ショックの情報に加え、ドーパミンによる強化も必要であり、匂いや、電気ショックによってドーパミン放出がおこる。そこで研究代表者は、NRMg-/-において電気ショックによるMBの細胞内カルシウム濃度([Ca2+]i)の上昇とドーパミン受容体の活性化の協調が、逆行条件付け成立の鍵となっていると考え、ドーパミン受容体のノックダウンを行った。その結果、抑制系の受容体であるDD2RををMBでノックダウンすると逆行条件付けで条件付けが成立した。このことから、[Ca2+]iの変化がDD2Rの活性化 / 不活性化に関与する事が考えられたため、DDRの細胞内ドメインを調べるとCa2+/Calmodulin(CaM)の結合部位が2カ所あること、さらに実際この結合部位にCa2+/CaMが結合することを見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
逆行条件付けで条件付け成立に関与する分子、NMDA受容体とDop2Rを見いだすことができた。さらにNRの活性化（[Ca2+]iの上昇）とドーパミン受容体の活性化、不活性化にに強い関係がある可能性を見いだすことができた。しかし、培養細胞の再構成系を立ち上げるにあたり、どの細胞でcAMPイメージングを行うかがなかなか決まらなかったことから、計画よりやや遅れてしまった。
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| Strategy for Future Research Activity |
DDR2にCa2+/CaM が結合することが明らかになった。そこで、培養細胞にDD2Rを発現させ、ドーパミンと Forskolin 添加時と、それらに加えCa2+ ionophoreを同時に添加して[Ca2+]iを上昇させた時で、cAMP産生の抑制能を比較する。これらにより、DD2Rの活性化が[Ca2+]iによって調整されていることを明らかにしていく。また、ドーパミンによってcAMP産生を活性化させるDD1R1と、DD2Rを同時に細胞に発現させ、ドーパミン添加時と、ドーパミン＋ Ca2+ ionophoreを加えたときのcAMP濃度変化をイメージングによって調べる。この実験により同一細胞にDD1R1とDD2Rが同時に発現する場合にどちらの受容体が活性化するかが、[Ca2+]iによって調整されていることを明らかにしていく。calmodulin-binding motif に変異を入れ、Calmodulin の結合はなくなるが、G-protein の結合は阻害しない変異 (DDR2Ca-/-)を見つけ、cAMP 産生の抑制能を比較する。変異体が作成できた場合、遺伝子編集技術を用い DDR2Ca-/-変異ショウジョウバエを作成し行動実験を行う。これらの実験を行う事で、NRのMg2+ blockのON/OFFが、US 情報が MB に入力するか否かを決めるだけでなく、CS と US の順序探知機として働き、その下流で DDR2 の活性制御も行うことで、条件付けの成立、不成立をコントロールしていることを明らかに出来ると考えている。
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| Causes of Carryover |
cAMPイメージングに使用する培養細胞がなかなか決まらず、当初の計画より遅れてしまった。そのためイメージングに必用な薬剤や培養機器を購入せずにいたため次年度使用額が生じた。培養細胞の選定がほぼ終了したため、cAMPイメージングを行う。さらにcalmodulin-binding motif に変異を入れ、Calmodulin の結合はなくなるが、G-protein の結合は阻害しない変異 (DDR2Ca-/-)を見つけ、cAMP 産生の抑制能を比較する。変異体が作成できた場合、遺伝子編集技術を用い DDR2Ca-/-変異ショウジョウバエを作成し行動実験を行う。これらの実験を行う事で、NRのMg2+ blockのON/OFFが、US 情報が MB に入力するか否かを決めるだけでなく、CS と US の順序探知機として働き、その下流で DDR2 の活性制御も行うことで、条件付けの成立、不成立をコントロールしていることを明らかに出来ると考えている。
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