2023 Fiscal Year Research-status Report
Functional morphology of mice that can be visualized neuron-specific autophagy under stress
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21K06412
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
田中 雅樹 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80264753)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
渡邊 義久 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (50363990)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | オートファジー / 神経細胞 / GFP-LC3-RFP / トランスジェニックマウス / NPY |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究室で作製した神経特異的なオートファジー活性可視化マウスの解析に取り組んでいるが、繁殖の過程でなかなかホモ接合体のマウスが生まれず、苦労している。
神経特異的なsyn1プロモーター下にニューロンに発現する、SYN1-GFP-LC3-RFPトランスジェニックマウスの脳組織発現について脳全体について調べた。嗅球、線条体、海馬、橋核などにGFPを発現する細胞が出現した。大脳皮質や海馬でNeuNとの共存が見られるが、GFAPとの共存は見られず、これら発現細胞はニューロンであることが確かめられた。特に嗅球や海馬、線条体には軸索や樹状突起のような突起にGFPが出現し、RFPは主に細胞体に見られた。RFPは大脳皮質や海馬に発現があり、領域によって、ベースのオートファジー活性が異なることが示唆された。トランスジェニックマウスの初代培養細胞を用いた薬剤投与実験で、オートファジーを抑制するバフィロマイシンA1を投与するとGFP-LC3の凝集がみられ、オーファジーレセプターであるP62の凝集と共存が見られた。オートファジー活性化が進むと、GFPとRFPの比が低下することになるが、実際オートファジー誘導剤である、リチウムを飲水に混ぜて1か月投与させると、海馬錐体細胞の細胞体、樹状突起でGFP/RFPが低下した。今年度培養細胞や動物脳局所のオートファジー活性を上げたり、阻害させたりして詳細な検討を行う研究とATG5 floxマウスを用いた解析：SYN1-GFP-LC3-RFPマウスとATG5 floxマウスを交配してホモマウスを作製し、脳局所AAV-Creを感染させることにより、コンディショナルにATG5を脳局所でノックアウトしてオートファジーを止める研究を計画している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
SYN1-GFP-LC3-RFPトランスジェニックマウスの繁殖は生まれた、新生仔を母マウスが喰殺してしまい、思った以上に時間がかかることが判明した。そのためケージの中に育児ハウスを設けたり、バイトチップを与えたりして、ストレスを軽減させることで、ようやく仔マウスが増えたが、なぜか遺伝子検査では、ホモが出生していない。
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| Strategy for Future Research Activity |
ホモマウスの出現を待って以下のプロジェクトを進める予定である。
１．初代培養細胞を用いた検索：2024年度はマウス海馬初代培養細胞を用いた解析を行って、オートファジーを止めたり、促進させたりすることによる、GFP-LC3やRFPの細胞内動態を組織細胞化学的に詳細に検討するとともにLC3抗体や抗GFP抗体を用いてウエスタンブロッティングによりオートファジーfluxを調べ、生化学的にもオートファジーを表現しているかどうかを確認する。
２．ATG5 floxマウスを用いた解析：SYN1-GFP-LC3-RFPマウスとATG5 floxマウスを交配してホモマウスを作製する。マイクロシリンジにて、脳局所AAV-Creを感染させることにより、コンディショナルにATG5を脳局所でノックアウトしてオートファジーを止める。
３．これまでのデータをまとめて、学会等で発表し、論文作成の準備を行う。
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| Causes of Carryover |
トランスジェニックマウスの繁殖に時間がかかり、2024年度も研究を遂行するために補助事業期間延長の申請を行い、承認された。ホモマウスを用いた初代培養細胞実験等の研究費と学会等で成果発表のための経費として計画している。
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| Remarks |
教室HPの業績欄
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