2022 Fiscal Year Research-status Report
The dynamics and physiological roles of molecular crowding at the presynaptic terminal
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21K06429
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| Research Institution | Osaka Medical and Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
江頭 良明 大阪医科薬科大学, 医学部, 講師 (80582410)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 分子クラウディング / 神経筋接合部 / ゼブラフィッシュ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
神経機能の基礎をなすシナプス伝達は、シナプス終末という微小空間で多数の分子が密に関わりあう一連の反応により生じる。近年、細胞内でタンパク質などの高分子が混みあって存在する状態（分子クラウディング）が、個々の生体分子の機能に重要であることが明らかになってきた。特にシナプス終末では、相分離を起こすタンパク質が液滴状の構造体（非膜性オルガネラ）を形成し、内部に高密度のタンパク質複合体を集積していることが示されたことで、シナプス機能に分子クラウディングの果たす役割が注目されている。しかし、分子クラウディングとシナプス伝達の関係を評価する研究は依然手が付けられていない。そこで本研究では、イメージング技術を駆使して、シナプス終末での分子クラウディングの動的変化を明らかにするとともに、シナプス伝達に対するその生理的役割を解明することを目指す。
標本として、遺伝的操作が容易であり、かつ生理的環境でのライブイメージングに適したゼブラフィッシュ仔魚の神経筋接合部を用いた。初年度(令和3年度)は、分子クラウディングとシナプス伝達の両方をイメージングするために、運動ニューロンの細胞質に分子クラウディングセンサーとなるFRETプローブを、シナプス終末のシナプス小胞内にpH感受性の赤色蛍光タンパク質を発現したトランスジェニックゼブラフィッシュを作成しライブイージングを行った。予備実験の結果から、シナプス終末の分子クラウディングと融合するシナプス小胞の量の間に負の相関があることが示唆されたが、赤色pHセンサーの実用性に問題があることが判明したため、今年度は、それをHaloTagに置換したTgフィッシュを新たに作成し、再度検討した。これまでに、逆に両者には正の相関があることが示唆されている。この結果は、シナプス前部の分子クラウディングが神経伝達に影響している可能性を示すが、今後さらに詳細な検討が必要である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究課題では、シナプス終末の分子クラウディングが、①神経の活動によって変化しうるかという点と、②逆に神経活動（シナプス伝達）に影響するかという、２つの点を検証することを目的としている。この２点をともに検証するために、分子クラウディングを測定するFRETプローブに加えて、シナプス小胞内にpH感受性の赤色蛍光タンパク質を同時発現するトランスジェニックゼブラフィッシュを作成した。シナプス伝達を可視化する目的では、pHluorinという緑色のpH感受性蛍光タンパク質がもっともよく使用されており、ゼブラフィッシュ神経筋接合部でもすでに実績があるが（Egashira et al., 2022 J Neurosci）、本研究ではFRETプローブと両立させるために比較的最近開発された赤色タンパク質（pHuji）を利用した。今回作成したトランスジェニックゼブラフィッシュにおいて
も、pHluorin同様にシナプス伝達を反映して蛍光強度の増大を観察することができたが、その変化量はpHluorinに比べると非常に小さいものであった。そのため②の点を検証するには実用的でないことが判明した。そこで赤色のpHセンサーをHaloTagといわれるタグタンパク質に置き換えたトランスジェニックゼブラフィッシュを作成しなおしたため、進捗状況はやや遅れている。HaloTagにはpH感受性の蛍光色素を含め様々な蛍光色素を結合させることが可能であるため、今後この魚を利用し①と②の両方を同時に検証していく予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度新たに作成したトランスジェニックゼブラフィッシュは、運動神経細胞質に分子クラウディングのFRETプローブを発現するとともに、運動神経終末のシナプス小胞内にHaloTagを発現している。この魚に対し、神経発火時に膜非透過性のHaloTagリガンド蛍光色素によるラベリングを行い、さらにその後で膜透過性のhaloTagリガンド蛍光色素によるラベリングを追加することで、様々な刺激条件下での全シナプス小胞における利用可能なシナプス小胞の割合を定量することが可能である。その割合とシナプス前終末の分子クラウディングの間に相関がないかを厳密に検証する予定である。神経細胞の刺激条件としては、高濃度カリウム溶液やチャネルロドプシンを利用した光刺激を想定している。このオプトジェネティクス実験に必要なトランスジェニックゼブラフィッシュはすでに作成が完了している。
さらに、HaloTagをpH感受性の蛍光色素でラベルすることも可能である（Egashira et al., 2022 J Neurosci）。そのライブイメージングを行うことによっても、シナプス伝達と細胞質の分子クラウディングの間に相関があるかどうか、またその結果が上記の実験結果と一致するかどうかを検証することを予定している。また同時に、神経刺激時のライブイメージングはプレシナプスの分子クラウディングが神経活動に伴って変化するかどうかを検証することにもなる。
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| Causes of Carryover |
購入を検討していたメーカーの顕微鏡用カメラが世界的な半導体不足により納期が未定となったため、そのための予算を繰り越して、購入を次年度に先延ばすことにした。
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