2022 Fiscal Year Research-status Report

Structural analyses of PMP22 and MPZ to elucidate the molecular mechanism of Charcot-Marie-Tooth disease

Research Project

Project/Area Number	21K06515
Research Institution	Yokohama City University
Principal Investigator	坂倉正義横浜市立大学, 生命医科学研究科, 准教授 (20334336)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	三尾和弘国立研究開発法人産業技術総合研究所, 材料・化学領域, ラボチーム長 (40470041) 田辺幹雄大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構, 物質構造科学研究所, 特任准教授 (00716871)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	シャルコー・マリー・トゥース病
Outline of Annual Research Achievements	我々は先行研究で、シャルコー・マリー・トゥース病（CMT）の原因遺伝子産物であるミエリンタンパク質ゼロ（MPZ）の細胞外ドメイン（ECD）が、MPZの膜接着活性の発現に重要な８量体形成残基とは異なる残基を介してホモ相互作用（S相互作用）を形成することを見出している。本年度は、S相互作用領域上における３種類のCMT関連アミノ酸残基置換（W72C, D80N, V84F）がMPZ-ECDに及ぼす影響を解析した。 W72C変異型ECD（W72C-ECD）について粒子サイズと膜接着活性の解析を行った結果、W72C-ECDが膜接着活性を有していないジスルフィド結合性の２量体を形成することが示された。さらに、W72C-ECDのCDスペクトルはβシート形成を示したが、NMR解析では、タンパク質の凝集を示唆するスペクトルパターンが観測された。W72C-MPZは、タンパク質凝集が起点となるGain-of-functionメカニズムでCMTを誘起する可能性が考えられる。 D80N-ECDについては、８量体に加えて、２量体および単量体と推定される状態が検出された。８量体は膜接着活性を保持していたが、単量体と考えられる成分については、膜接着活性が観測されなかった。一方、D80N-ECDのNMR解析の結果、S相互作用部位上の残基について、野生型(WT)よりも大きい濃度依存的化学シフト変化が観測され、D80N-ECDがWTと比較してS相互作用を形成しやすいことが示唆された。S相互作用の亢進とCMT発症の関連性は、現時点では不明である。 V84F-ECDは単量体として存在し、膜接着活性を有していなかった。V84F-ECDのNMR解析の結果、８量体形成に関与するH86においてWTとの化学シフト差が観測され、V84F変異がH86の構造変化を誘起することにより８量体形成を阻害し、MPZの膜接着能を失わせることが示唆された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason MPZについては、研究実施計画通りに研究が進み、疾患関連変異が分子構造・機能に与える影響が明らかにされつつある。 PMP22については、酵母発現系を用いたリコンビナントPMP22の調製条件の検討中である。
Strategy for Future Research Activity	S相互作用の亢進が観測されたD80N変異型MPZ-ECDについてSEC-MALS解析を行い、D80N-ECDの会合状態を明らかにする。また、D80NがS相互作用に与える影響を８量体化の影響を排除した状態で定量的に解析するため、これまでに単量体として存在することが示されているW28A等の変異体にD80N変異を導入した二重変異体を調製し、NMR解析を行う。 PMP22については、N末端にBRILを融合させたリコンビナントBRIL-PMP22融合体の精製および結晶化に取り組む。
Causes of Carryover	NMR解析用タンパク質試料の精製に必要な安定同位体試薬の国内在庫がなく、購入できなかったため、予算を次年度に繰り越した。また、論文投稿用に確保していた予算を次年度に繰り越した。