2023 Fiscal Year Annual Research Report

Improvement of protein expression by Escherichia coli based on the structure of anti-P2X4 antibody Fab and development of its additional function.

Research Project

Project/Area Number	21K06517
Research Institution	International University of Health and Welfare
Principal Investigator	阿部義人国際医療福祉大学, 福岡薬学部, 教授 (60315091)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	山下智大九州大学, 薬学研究院, 講師 (30645635)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	抗P2X4抗体 / タンパク質工学 / タンパク質化学 / 大腸菌発現
Outline of Annual Research Achievements	本研究計画では、痛み受容体であるP2X4に対する抗体Fabの大腸菌発現量上昇に関するデータ収集およびリコンビナントFabを用いた応用研究であるP2X4機能抑制抗体の創製を目的とした。我々は大腸菌から時間や手間暇のかかる巻き戻し系を使わずに、可溶性Fabを調製できる方法を確立した。さらに一アミノ酸変異を加えることにより、可溶性Fabの回収量を6~7倍増やした発現系を構築した。そこで本研究期間において、さらに発現量が増加する変異体の作製を試みた。その過程で発現量の増減を簡便に検出できる方法を開発し、発現量の増減が、抗体H鎖、L鎖間のアミノ酸側鎖の疎水性度に依存していることを見出した。発現量の増減が見られる変異体に関しては、精製後、熱や変性剤に対する安定性を測定し、その物理化学的な情報を得た。さらに精製した抗体Fabに関しては結晶化条件の検討を行った。これらの結果は国際医療福祉大学学会学術大会、および日本蛋白質科学会にて発表しており、今後学術論文として発表する予定である。また本研究期間では、抗体FabとATP加水分解酵素を化学的にコンジュゲートした機能性抗体を得る方法論の開発を試みた。化学修飾法を用いて、抗体Fabにシステインを導入した変異体とATP加水分解酵素を架橋反応させたが、架橋効率が低く、他の酵素、架橋剤、反応条件などを検討したが、反応効率は上がらなかった。一方で、システインに反応する蛍光修飾低分子化合物等は抗体Fabのシステインと反応しやすいことから、タンパク質間架橋の効率を上げるためには、次期の科研費検討課題で行うタンパク質間の相互作用を検討する必要があるのではないかと考えている。他のタンパク質ではあるが、本年度はタンパク質間相互作用に関しての検討を行っており、BBAに一報受理された。